人髓过氧化物酶(MPO)ELISA 试剂盒的应用

背景^[1-3]

人髓过氧化物酶(MPO)ELISA试剂盒应用双抗体夹心法测定标本中人髓过氧化物酶（MPO）水平。

实验原理：用纯化的人髓过氧化物酶（MPO）捕获抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被的微孔中依次加入人髓过氧化物酶（MPO），再与HRP标记的检测抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过彻底洗涤后加底物TMB显色。TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成终的黄色。颜色的深浅和样品中的人髓过氧化物酶（MPO）呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），通过标准曲线计算样品中人髓过氧化物酶（MPO）含量。

人髓过氧化物酶(MPO)

操作步骤：

1.从室温平衡20min后的铝箔袋中取出所需板条，剩余板条用自封袋密封放回4℃。

2.设置标准品孔和样本孔，标准品孔各加不同浓度的标准品50μL；样本孔加待测样本50μL。

3.样本孔先加待测样本10μL，再加样本稀释液40μL；空白孔不加。

4.除空白孔外，标准品孔和样本孔中每孔加入辣根过氧化物酶（HRP）标记的检测抗体100μL，用封板膜封住反应孔，37℃水浴锅或恒温箱温育60min。

5.弃去液体，吸水纸上拍干，每孔加满洗涤液，静置1min，甩去洗涤液，吸水纸上拍干，如此重复洗板5次（也可用洗板机洗板）。

6.每孔加入底物A、B各50μL，37℃避光孵育15min。

7.每孔加入终止液50μL，15min内，在450nm波长处测定各孔的OD值。

应用^[4][5]

用于基于家蚕—杆状病毒表达系统制备人髓过氧化物酶的研究

通过将完整的人髓过氧化物酶MPO的cDNA克隆到带有6个组氨酸的供体质粒上,获得含人MPO基因的重组供体质粒;在大肠杆菌BmDH10Bac中和家蚕杆状病毒基因组杆粒（Bacmid）于转座子（Tn7）上发生转座,通过蓝白斑筛选出带有目的基因的克隆;随后在家蚕BmN细胞中制备含人MPO基因的重组病毒;以制备的重组病毒感染宿主昆虫家蚕（Bombyx mori）,同时给家蚕添食一定量的血红素前体;收集含表达了人MPO的家蚕幼虫的体液,在裂解缓冲液存在下经超声波裂解,4℃下进行高速离心,收集的上清应用镍-柱亲和层析结合离子交换层析的方法进行分离纯化,最终获得目的产物人髓过氧化物酶。

分析结果表明,重组人MPO能够在家蚕体内得到很好的表达和包装,蛋白质翻译后的（糖基化）修饰良好,分离纯化后的蛋白比活性达396.7±41.7 milliunits/mg,且能够被病人阳性血清所识别。

利用家蚕-杆状病毒表达系统在五龄家蚕中制备的人重组MPO具与来源于人嗜中性粒细胞表达的MPO相当的比活性;且表达量高:平均每条蚕可制备高达1.7微克左右目的蛋白;成本低:由于避免了AcMNPV杆状病毒-Bac-to-Bac表达系统中昆虫细胞培养所需昂贵的培养基和胎牛血清,且家蚕饲养简单方便。

参考文献

[1]The role of neutrophils in causing antineutrophil cytoplasmic autoantibody-associated vasculitis[J].Adrian Schreiber,Mira Choi.Current Opinion in Hematology.2015(1)

[2]MultiBac turns sweet[J].Dieter Palmberger,Miriam Klausberger,Imre Berger,Reingard Grabherr.Bioengineered.2013(2)

[3]Genetic modification of a baculovirus vector for increased expression in insect cells[J].Richard B.Hitchman,Robert D.Possee,Andrew T.Crombie,Adam Chambers,Kim Ho,Evangelia Siaterli,Olga Lissina,Heather Sternard,Robert Novy,Kathryn Loomis,Louise E.Bird,Raymond J.Owens,Linda A.King.Cell Biology and Toxicology.2010(1)

[4]Signal peptide design for improving recombinant protein secretion in the baculovirus expression vector system[J].Mutsumi Futatsumori-Sugai,Kouhei Tsumoto.Biochemical and Biophysical Research Communications.2009(1)

[5]陈俏梅.基于家蚕—杆状病毒表达系统制备人髓过氧化物酶的研究[D].江苏大学,2016.