大鼠视网膜神经节细胞的应用

背景^[1-3]

大鼠视网膜神经节细胞采用胶原酶消化和密度梯度离心制备而来，细胞纯度可达85%以上，且不含有HIV-1、HBV、HCV、支原体、细菌、酵母和真菌等。

大鼠视网膜神经节细胞来源于成年大鼠神经层视网膜组织，细胞贴壁后呈单层排列，部分细胞聚集成团，细胞呈圆形或椭圆形，核圆且相对透明，有些细胞膜上伸出短而小的突起。RGCs是青光眼病理性损害的主要细胞，RGCs的死亡可导致视功能不可逆损伤，研究RGCs损害的细胞学和分子生物学机制有利于青光眼发病机制的研究。

大鼠视网膜神经节细胞

操作步骤：

1.取出25cm2培养瓶，75%酒精消毒，拆下封口膜，放入37℃，5%CO2细胞培养箱中静置6-8小时或者过夜，以稳定细胞状态。

2.视网膜神经节细胞为终末分化的细胞，建议直接使用，不建议扩大培养。

3.待细胞状态时准备转孔培养，进行实验：

1)吸出25cm2培养瓶中的培养基，用PBS清洗细胞一次；

2)添加0.125%胰蛋白酶消化液约1mL至培养瓶中，37℃温浴2~3min左右；倒置显微镜下观察，待细胞回缩变圆后吸弃消化液，再加入完全培养液终止消化；

3)用吸管轻轻吹打混匀，按1:2或1:3等适当的比例进行接种传代，然后补充新鲜的完全培养基至5mL，放入37℃，5%CO2细胞培养箱中培养；

4)待细胞完全贴壁后，培养观察。之后每隔2-3天更换新鲜的完全培养基。

应用^[4][5]

用于RCS大鼠视网膜重构中谷氨酸变化对神经节细胞的影响研究

通过研究RCS大鼠视网膜重构过程中谷氨酸的释放、摄取和转化各阶段的变化规律，以及谷氨酸作为神经递质的输出改变对视网膜节细胞功能的影响，进而揭示视网膜变性过程中谷氨酸改变对视网膜神经节细胞存活的影响，以及变性过程中视网膜神经节细胞电生理功能的改变，为视网膜变性后神经元的保护、视功能挽救和重建提供线索，为视网膜重构的基础研究和临床治疗研究提供理论依据。

方法1、采用免疫组织化学技术研究重构视网膜中蛋白激酶C的α亚单位（PKCα）和谷氨酰胺合成酶（GS）的分布；实时定量逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）检测不同时间点重构视网膜中PKCα与VGLUT-1mRNA表达量的变化规律；

2、Western免疫印迹技术检测视网膜中GLAST蛋白和GS蛋白的表达水平；

3、膜片钳技术检测不同时间点视网膜神经节细胞对谷氨酸的电生理反应性，最终阐明视网膜变性过程中，视网膜神经节细胞的电生理功能的变化规律。

结果1.RCS大鼠视网膜变性首先累及光感受器细胞，存活的视杆双极细胞所占百分比随变性发展逐渐增高；到视网膜变性晚期，内核层和节细胞层的细胞仍有大量残留。

2. RCS大鼠视网膜变性发展到中后期，作为神经递质的谷氨酸释放逐渐增多，但Müller细胞摄取谷氨酸的能力并不相应地增加，只是Müller细胞内对谷氨酸的转化能力逐渐增强；到视网膜变性晚期，谷氨酸的释放量相对减少。

3.正常大鼠视网膜神经节细胞钳制在-80mV水平下受光刺激后诱发的内向电流包括三种成份，即AMPA受体成份，GABA受体成份，诱发动作电位后产生的Na＋内流成份；在此钳制电压下，视网膜神经节细胞主要通过AMPA受体和GABA受体接受上级神经元的输入；并且内向电流强度随年龄增加无明显改变，稳定在一定水平，且谷氨酸电流强度也无明显改变；NBQX不影响视网膜神经节细胞内向电流的各时程

参考文献

[1]Preferred therapies for neovascular age-related macular degeneration[J].Allen Chiang,Carl D Regillo.Current Opinion in Ophthalmology.2011(3)

[2]Ranibizumab treatment in patients with neovascular age‐related macular degeneration and very low vision[J].Acta Ophthalmologica.2011(1)

[3]Complexity of retinal cone bipolar cells[J].Enrica Strettoi,Elena Novelli,Francesca Mazzoni,Ilaria Barone,Devid Damiani.Progress in Retinal and Eye Research.2010(4)

[4]Correlation of complement factor H gene polymorphisms with exudative age-related macular degeneration in a Chinese cohort[J].Lun Dong,Yi Qu,Hua Jiang,Hong Dai,Fang Zhou,Xiaoyi Xu,Hongsheng Bi,Xuemei Pan,Guangfu Dang.Neuroscience Letters.2010(3)

[5]刘康.RCS大鼠视网膜重构中谷氨酸变化对神经节细胞的影响研究[D].第三军医大学,2013.