人莱姆病IGG(LYME IGG)ELISA试剂盒的应用

背景^[1-3]

人莱姆病IGG(LYME IGG)ELISA试剂盒用于体外定量检测血清、血浆、组织、细胞上清及相关液体样本中人莱姆病IgG（Lyme IgG）的含量。

实验原理:试剂盒采用双抗体一步夹心法酶联免疫吸附法，往预先包被人莱姆病IgG（Lyme IgG）捕获抗体的包被微孔中，依次加入标本、标准品、HRP标记的检测抗体，经过温育并彻底洗涤。用底物TMB显色，TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的人莱姆病IgG（Lyme IgG）呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），计算样品浓度。

人莱姆病IGG(LYME IGG)ELISA试剂盒

操作步骤：

1.加样：分别设空白孔、标准孔、待测样品孔。空白孔加样品稀释液100μl，余孔分别加标准品或待测样品100μl，注意不要有气泡，加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀，酶标板加上盖或覆膜，37℃反应120分钟。

2.弃去液体，甩干，不用洗涤。每孔加生物素标记抗体工作液100μl（取1μl生物素标记抗体加99μl生物素标记抗体稀释液的比例配制，轻轻混匀，在使用前一小时内配制），37℃,60分钟。

3.温育60分钟后，弃去孔内液体，甩干，洗板3次，每次浸泡1-2分钟，350μl/每孔，甩干。

4.每孔加辣根过氧化物酶标记亲和素工作液（同生物素标记抗体工作液）100μl，37℃，60分钟。

5.温育60分钟后，弃去孔内液体，甩干，洗板5次，每次浸泡1-2分钟，350μl/每孔，甩干。

6.依序每孔加底物溶液90μl，37℃避光显色（30分钟内，此时肉眼可见标准品的前3-4孔有明显的梯度蓝色，后3-4孔梯度不明显，即可终止）。

7.依序每孔加终止溶液50μl，终止反应（此时蓝色立转黄色）。终止液的加入顺序应尽量与底物液的加入顺序相同。为了保证实验结果的准确性，底物反应时间到后应尽快加入终止液。

8. 用酶联仪在450nm波长依序测量各孔的光密度（OD值）。在加终止液后15分钟以内进行检测。

应用^[4][5]

用于中国莱姆病螺旋体OspA肽段和OspC组合的多价亚单位疫苗的初步研究

研究旨在克隆表达中国莱姆病螺旋体主要致病基因型B.garinii基因型代表菌株PD91外膜蛋白A（OspA）的126-274aa肽段（缩写:PD91-rOspA-pep）,并且探究其与中国莱姆病螺旋体B.garinii和B.afzelii基因型的OspC蛋白组合的重组多价亚单位疫苗的免疫保护性,从而为中国莱姆病亚单位疫苗的研制提供基础。

采用聚合酶链反应（PCR）扩增莱姆病螺旋体PD91的126-274aa OspA肽段基因,克隆至原核表达载体pET-30a上,构建pET-30a-OspA-pep重组质粒,转入大肠杆菌感受态细胞BL21（DE3）中,利用IPTG诱导表达,表达产物用Ni-IDA树脂层析纯化,SDS-PAGE电泳检测、并通过Western blot分析其免疫原性。

将不同剂量的rOspA-pep蛋白（20μg、30μg、40μg、50μg、60μg、80μg、100μg）免疫新西兰家兔,采用间接免疫荧光方法（IFA）检测免疫前后的抗体滴度,选取产生抗体滴度最高的剂量组为剂量组,并用剂量组的免疫兔血清进行体外中和试验以检测rOspA-pep蛋白的体外杀菌能力;用剂量的rOspA-pep蛋白免疫新西兰家兔,观察其抗体滴度变化。

参考文献

[1]Essential role for OspA/B in the life cycle of the Lyme disease spirochete.Yang Xiaofeng F,Pal Utpal,Alani Sophie M,Fikrig Erol,Norgard Michael V.The Journal of experimental medicine.2004

[2]Crystal structure of Lyme disease antigen outer surface protein C from Borrelia burgdorferi.Eicken C,Sharma V,Klabunde T,Owens R T,Pikas D S,Hk M,Sacchettini J C.Journal of Biological Chemistry.2001

[3]Design and development of a novel vaccine for protection against Lyme borreliosis.Comstedt P,Hanner M,Schuler W,et al.PLoS one.2014

[4]Genome stability of Lyme disease spirochetes:comparative genomics of Borrelia burgdorferi plasmids.Casjens Sherwood R,Mongodin Emmanuel F,Qiu Wei-Gang,Luft Benjamin J,Schutzer Steven E,Gilcrease Eddie B,Huang Wai Mun,Vujadinovic Marija,Aron John K,Vargas Levy C,Freeman Sam,Radune Diana,Weidman Janice F,Dimitrov George I,Khouri Hoda M,Sosa Julia E,Halpin Rebecca A,Dunn John J,Fraser Claire M.PloS one.2012

[5]苗广青.中国莱姆病螺旋体OspA肽段和OspC组合的多价亚单位疫苗的初步研究[D].中国疾病预防控制中心,2020.