人端粒酶逆转录酶(TERT)ELISA试剂盒的应用

背景^[1-3]

人端粒酶逆转录酶(TERT)ELISA试剂盒应用双抗体夹心法测定标本中端粒酶逆转录酶TERT水平。

人端粒酶逆转录酶(TERT)

原理：用纯化的端粒酶逆转录酶TERT抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入端粒酶逆转录酶TERT，再与HRP标记的端粒酶逆转录酶TERT抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过彻底洗涤后加底物TMB显色。

TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的端粒酶逆转录酶TERT呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），通过标准曲线计算样品中端粒酶逆转录酶TERT浓度。

操作步骤:

1.标准品的加样：设置标准品孔和样本孔，标准品孔各加不同浓度的标准品50μL

2.加样：分别设空白孔（空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同）、待测样品孔。在酶标包被板上待测样品孔中先加样品稀释液40μl，然后再加待测样品10μl（样品最终稀释度为5倍）。加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀。

3.加酶：每孔加入酶标试剂100μl，空白孔除外。

4.温育：用封板膜封板后置37℃温育60分钟。

5.配液：将20倍浓缩洗涤液用蒸馏水20倍稀释后备用。

6.洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去，如此重复5次，拍干。

7.显色：每孔先加入显色剂A50μl，再加入显色剂B50μl，轻轻震荡混匀，37℃避光显色15分钟.

8.终止：每孔加终止液50μl，终止反应（此时蓝色立转黄色）。

9.测定：以空白孔调零，450nm波长依序测量各孔的吸光度（OD值）。测定应在加终止液后15分钟以内进行。

应用^[4][5]

用于人端粒酶逆转录酶（hTERT）促胃癌侵袭转移的分子机制研究

拟阐明hTERT调控胃癌细胞肝素酶表达进而促进胃癌侵袭转移的作用及分子机制,为以htert为靶点的胃癌诊断及治疗提供新的理论依据。

研方法1.体外侵袭及体内转移实验,证实htert对胃癌细胞侵袭转移的调控作用;

2. 采用双荧光素酶、qpcr及westernblot检测htert对肝素酶启动子活性、mrna及蛋白表达的影响,证实htert可调控肝素酶的转录表达;

3. 生物信息学及qpcr实验筛选确定介导htert调控肝素酶表达的核转录因子;

4. 双荧光素酶及westernblot实验检测过表达或干扰c-myc对肝素酶启动子活性和蛋白表达的影响,并利用chip实验检测c-myc与肝素酶启动子结合情况,证实c-myc可通过结合肝素酶启动子而调控肝素酶转录表达;

5. 突变肝素酶启动子的c-myc结合位点或干扰c-myc表达,分别用双荧光素酶及westernblot实验检测htert对肝素酶启动子活性和蛋白表达的影响,进一步证实c-myc可介导htert对肝素酶的表达调控;

6. 采用免疫共沉淀（co-ip）、免疫荧光共定位、chip及re-chip实验,证实htert可与c-myc形成复合物并通过c-myc结合于肝素酶启动子区;

7. 分别干扰或过表达htert及c-myc,通过双荧光素酶及westernblot实验检测肝素酶启动子活性和蛋白表达,证实两者是肝素酶转录表达激活的必须调控分子;

8. 采用top/fop实验、免疫荧光及westernblot实验证实htert可促进β-catenin核转位和转录活化,进一步通过wnt/β-catenin信号通路促进c-myc的表达上调,证实htert与c-myc存在相互调控的反馈通路;

9. 体外侵袭及体内动物实验检测干扰肝素酶表达对htert调控胃癌细胞生物学行为的影响,证实htert通过上调肝素酶表达促胃癌侵袭转移的作用;

10.免疫组化检测htert、c-myc及肝素酶在胃癌及癌旁组织的表达情况,分析三者表达的相关性及与患者临床病理特征和预后的关系。

参考文献

[1]Ferroptosis:Death by Lipid Peroxidation[J].Wan Seok Yang,Brent R.Stockwell.Trends in Cell Biology.2016(3)

[2]Activation of the p62‐Keap1‐NRF2 pathway protects against ferroptosis in hepatocellular carcinoma cells[J].Xiaofang Sun,Zhanhui Ou,Ruochan Chen,Xiaohua Niu,De Chen,Rui Kang,Daolin Tang.Hepatology.2016(1)

[3]Metabolism and iron signaling in ferroptotic cell death.[J].Gao Minghui,Monian Prashant,Jiang Xuejun.Oncotarget.2015(34)

[4]Ferroptosis is Involved in Acetaminophen Induced Cell Death.[J].Lrincz Tamás,Jemnitz Katalin,Kardon Tamás,Mandl József,Szarka András.Pathology oncology research:POR.2015(4)

[5]唐波.人端粒酶逆转录酶（hTERT）促胃癌侵袭转移的分子机制研究[D].第三军医大学,2016.