人凋亡抑制因子4 ELISA KIT的应用

背景^[1-3]

人凋亡抑制因子4 ELISA KIT可以用于体外检测人凋亡抑制因子4在样本中的含量。

原理：用纯化的抗体包被微孔板，制成固相载体，往包被抗该指标抗体的微孔中依次加入标本或标准品、生物素化的抗该指标抗体、HRP标记的亲和素，经过彻底洗涤后用底物TMB显色。TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成的黄色。颜色的深浅和样品中的该指标呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），计算样品浓度。

人凋亡抑制因子4

操作步骤：

1.加样：分别设空白孔、标准孔、待测样品孔。空白孔加样品稀释液100μl，余孔分别加标准品或待测样品100μl，注意不要有气泡，加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀，酶标板加上盖或覆膜，37℃反应120分钟。

2.弃去液体，甩干，不用洗涤。每孔加生物素标记抗体工作液100μl（取1μl生物素标记抗体加99μl生物素标记抗体稀释液的比例配制，轻轻混匀，在使用前一小时内配制），37℃,60分钟。

3.温育60分钟后，弃去孔内液体，甩干，洗板3次，每次浸泡1-2分钟，350μl/每孔，甩干。

4.每孔加辣根过氧化物酶标记亲和素工作液（同生物素标记抗体工作液）100μl，37℃，60分钟。

5.温育60分钟后，弃去孔内液体，甩干，洗板5次，每次浸泡1-2分钟，350μl/每孔，甩干。

6.依序每孔加底物溶液90μl，37℃避光显色（30分钟内，此时肉眼可见标准品的前3-4孔有明显的梯度蓝色，后3-4孔梯度不明显，即可终止）。

7.依序每孔加终止溶液50μl，终止反应（此时蓝色立转黄色）。终止液的加入顺序应尽量与底物液的加入顺序相同。为了保证实验结果的准确性，底物反应时间到后应尽快加入终止液。

8.用酶联仪在450nm波长依序测量各孔的光密度（OD值）。在加终止液后15分钟以内进行检测。

应用^[4][5]

用于程序性细胞死亡4增强胃癌细胞对TRAIL的敏感性及机制研究

TRAIL可以诱导胃癌细胞或肝癌细胞的凋亡,并且发现了一些可调控TRAIL敏感性的因子如端粒酶逆转录酶、DNMT1基因及阿司匹林。

观察了PDCD4对TRAIL敏感性的影响,并对FLIP和PI3K/Akt途径在此过程中的作用进行了研究。

方法1.细胞株和抗体人胃癌细胞株MKN28、SGC7901、BGC823于含10%标准胎牛血清的RPMI1640培养基,37℃、5%CO2孵箱内培养。可溶性重组人TRAIL购自ProSpect（以色列）;羊抗人PDCD4、鼠抗人FLIP、鼠抗人caspase-8及活化的caspase-8（cleaved-caspase-8）（p41/43）、鼠抗人Akt及磷酸化Akt（p-Akt）购自SantaCruz（美国）;鼠抗人β-actin、辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase,HRP）包被的羊抗鼠二抗、兔抗羊二抗、羊抗兔二抗购自Boister（中国）。

2.含PDCD4基因质粒构建和转染pBluescriptR-PDCD4质粒（Invitrogen,美国）经限制性内切酶BamH I、EcoR I双酶切后获得PDCD4 cDNA片段。将PDCD4片段亚克隆至真核表达载体pIRES2-EGFP（全军烧伤研究所）,转染至感受态大肠杆菌DH5α,接种至含30%卡那霉素的LB培养皿中,挑取单个菌落进行扩大培养,提取质粒并经酶切及测序鉴定获得含PDCD4基因的质粒,命名为pIRES2-PDCD4。利用脂质体2000（Invitrogen）转染至胃癌细胞BGC823中。转染细胞经G418筛选3 W,获得表达绿色荧光的单个细胞克隆,进行扩大培养,获得稳定过表达PDCD4的细胞系。

参考文献

[1]c‐FLIP expression in colorectal carcinomas:association with Fas/FasL expression and prognostic implications[J].PKorkolopoulou,A ASaetta,GLevidou,FGigelou,ALazaris,IThymara,MScliri,KBousboukea,N VMichalopoulos,NApostolikas,AKonstantinidou,MTzivras,EPatsouris.Histopathology.2007(2)

[2]TRAIL receptor-targeted therapy[J].Donald J Buchsbaum,Tong Zhou,Albert F LoBuglio.Future Oncol..2006(4)

[3]The E3 Ubiquitin Ligase Itch Couples JNK Activation to TNFα-induced Cell Death by Inducing c-FLIP L Turnover[J].Lufen Chang,Hideaki Kamata,Giovanni Solinas,Jun-Li Luo,Shin Maeda,K.Venuprasad,Yun-Cai Liu,Michael Karin.Cell.2006(3)

[4]Differential expression in normal-adenoma-carcinoma sequence suggestscomplex molecular carcinogenesis in colon[J].Seungkoo Lee,Seunghyun Bang,Kyuyoung Song,Inchul Lee.Oncology Reports.2006(4)

[5]王伟强.程序性细胞死亡4增强胃癌细胞对TRAIL的敏感性及机制研究[D].第三军医大学,2009.