人真皮微血管内皮细胞的应用

背景^[1-3]

人真皮微血管内皮细胞提取于人真皮组织，原代冻存。此细胞通过vWF/Factor VIII和CD31(P-CAM)免疫荧光染色验证，经测试不含有HIV-1、HBV、HCV、支原体、细菌、酵母和真菌。

皮肤血管由多种细胞和非细胞物质组成。内皮细胞是构成皮肤血管主要细胞类型。内皮细胞不仅是血管内腔和血管外的分界，还是细胞和大分子物质扩散的选择性屏障。皮肤微血管内皮细胞与其它内皮细胞有着同之处，也有其自身特点。如能够活化参与多种生理过程，包括创伤愈合、止血、温度调节和炎症调整（白细胞运输）。内皮细胞的结构和功能在不同的时间和空间有着不同的变化。内皮细胞通过增殖、休眠、凋亡和老化这4个基本的细胞状态来建立皮肤微血管维持和重塑之间的动态平衡。

人真皮微血管内皮细胞

细胞培养步骤：

培养基及培养冻存条件准备：

1、培养液：内皮细胞培养基，sciencell

2、培养条件：气相：空气，95%；二氧化碳，5%。温度：37摄氏度，培养箱湿度为70%-80%。

3、冻存液：90%FBS+10%DMSO，现用现配。液氮储存。

细胞处理：

1、复苏细胞：将含有1mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加入4mL培养基混合均匀。在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入培养瓶中培养过夜（或将细胞悬液加入10cm皿中，加入约8ml培养基，培养过夜）。第二天换液并检查细胞密度。

2、细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。

应用^[4][5]

用于人真皮微血管内皮细胞的提取及其低氧后处理模型的建立

参考国内外皮瓣真皮微血管内皮细胞提取方法,采用酶消化加磁珠分选的方法提取人皮瓣微血管内皮细胞。确定低氧后处理的的缺氧和复氧时间,建立低氧后处理模型。

方法：采用酶消化联合磁珠分选法得到人真皮微血管内皮细胞（HDMECs）,体外培养传至P5代,采用Ⅷ因子免疫荧光及CD309、CD34流式细胞学进行鉴定;检测乳酸脱氢酶（LDH）在随缺氧时间含量的变化;Tunel法染色计算各组的细胞凋亡率;用Western Blot的方法检测Bcl-2、Bax和Caspase-3以及活化Caspase-3的蛋白含量表达。

结果：1.细胞分离培养4d后,可见散在的细胞集落,周边有成纤维状细胞生长,细胞集落,生长7d后,可见细胞呈铺路石样排列;

2. 经第2次分选,可见细胞呈紧密排列的漩窝状或同心圆状外观,呈铺路石样排列。第二次CD31磁珠分选后阳性率>95%;

3. 二次CD31磁珠分选后流式细胞鉴定结果:CD309阳性率为（95.4±1.34）%;CD34阳性率为（42.5±3.23）%;

4.免疫荧光检测上清液中LDH:结果LDH随着缺氧时间的增加而加,8h与0h、2h、4h、6h相比LDH含量显著增加p<0.05,8h与12h差异性不显著p>0.05;5.Tunel和Western结果显示2min*3s和5min*3s的缺氧后处理（hypoxic postconditioning,H-post C）能够起到保护作用。

参考文献

[1]Comparing Different Postconditioning Cycles After Ischemia Reperfusion Injury in the Rat Skin Flap[J].O.Koray Coskunfirat,An Cinpolat,Gamze Bektas,Onur Ogan,Temmuz Taner.Annals of Plastic Surgery.2014(1)

[2]Involvement of the FoxO3a pathway in the ischemia/reperfusion injury of cardiac microvascular endothelial cells[J].Xu-Feng Qi,Yun-Jian Li,Zhuo-Ying Chen,Soo-Ki Kim,Kyu-Jae Lee,Dong-Qing Cai.Experimental and Molecular Pathology.2013(2)

[3]An in vitro model of warm hypoxia–reoxygenation injury in human liver endothelial cells[J].Neal R.Banga,K.Raj Prasad,J.Lance Burn,Shervanthi Homer-Vanniasinkam,Anne Graham.Journal of Surgical Research.2012(1)

[4]Quantitative histological assessment of hepatic ischemia-reperfusion injuries following ischemic pre-and post-conditioning in the rat liver[J].Journal of Surgical Research.2012

[5]鲁昆.人真皮微血管内皮细胞的提取及其低氧后处理模型的建立[D].南华大学,2015.