人B细胞活化因子(BAFF) ELISA KIT的应用

背景^[1-3]

人B细胞活化因子(BAFF)ELISA KIT采用双抗体一步夹心法酶联免疫可以检测样品中人B细胞活化因子(BAFF)的含量。

原理：用纯化的抗体包被微孔板，制成固相载体，往包被抗该指标抗体的微孔中依次加入标本或标准品、生物素化的抗该指标抗体、HRP标记的亲和素，经过彻底洗涤后用底物TMB显色。TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成的黄色。颜色的深浅和样品中的该指标呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），计算样品浓度。

操作步骤:

1）使用前，将所有试剂充分混匀。不要使液体产生大量的泡沫，以免加样时加入大量的气泡，产生加样上的误差。

2）根据待测样品数量加上标准品的数量决定所需的板条数。每个标准品和空白孔建议做复孔。每个样品根据自己的数量来定，能使用复孔的尽量做复孔。标本用标本稀释液1：1稀释后加入50ul于反应孔内。

3）加入稀释好后的标准品50ul于反应孔、加入待测样品50ul于反应孔内。立即加入50ul的生物素标记的抗体。盖上膜板，轻轻振荡混匀，37℃温育1小时。

4）甩去孔内液体，每孔加满洗涤液，振荡30秒，甩去洗涤液，用吸水纸拍干。重复此操作3次。如果用洗板机洗涤，洗涤次数增加一次。

5）每孔加入80ul的亲和链酶素-HRP，轻轻振荡混匀，37℃温育30分钟。

6）甩去孔内液体，每孔加满洗涤液，振荡30秒，甩去洗涤液，用吸水纸拍干。重复此操作3次。如果用洗板机洗涤，洗涤次数增加一次。

7）每孔加入底物A、B各50ul，轻轻振荡混匀，37℃温育10分钟。避免光照。

8）取出酶标板，迅速加入50ul终止液，加入终止液后应立即测定结果。

9）在450nm波长处测定各孔的OD值。

应用^[4][5]

用于B细胞活化因子与系统性红斑狼疮关联性的研究

探讨由B细胞活化因子（BAFF）所介导的B细胞激活对系统性红斑狼疮（SLE）的致病机理,寻找能从转录水平阻断BAFF基因激活的部分细胞因子以治疗SLE;

构建了克隆载体pMD18-T-BAFF作为定量模板,基于TaqMan荧光探针技术,建立检测BAFF基因表达水平的实时荧光定量RT-PCR方法;

联合自行建立的检测BAFF血清水平酶联免疫吸附测定（ELISA）方法,研究部分SLE患者的血清BAFF含量与外周血BAFF基因表达水平、免疫球蛋白（IgG、IgA、IgM）浓度、和抗双链DNA（ds-DNA）抗体滴度的相关性。

并从人BAFF基因上游5’侧翼区-1320～-300bp的片段中,取长度不等的片段作为启动子与含氯霉素乙酰基转移酶（CAT）报告基因的质粒组成5个重组体,转染上述重组体至靶细胞,测定细胞CAT表达水平以比较各重组体的启动子活性;加入细胞因子（IL-10、IL-4、IFN-γ、及重组BAFF分子）,以测定其对BAFF基因启动子活性的影响。

参考文献

[1]An anti-CD45RO immunotoxin eliminates T cells latently infected with HIV-1 in vitro.McCoig C,Van Dyke G,Chou C S,et al.Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America.1999

[2]Rational design of immunotoxins:current progress and future prospects.Wawrzynczak EJ.Anti Cancer Drugs.1992

[3]Treatment of hematologic malignancies with immunotoxins and antibody-drug conjugates.DJ FitzGerald,AS Wayne,RJ Kreitman,I Pastan.Cancer Research.2011

[4]Mucosal T cells expressing high levels of IL-7 receptor are potential targets for treatment of chronic colitis.Yamazaki M,Yajima T,Tanabe M,et al.Immunology.2003

[5]周琳.B细胞活化因子与系统性红斑狼疮关联性的研究[D].第二军医大学,2005.