超敏ECL化学发光试剂盒的应用

背景^[1-3]

超敏ECL化学发光试剂盒是化学发光系统，也称为超敏型ECL发光液，用于检测固定在膜上的蛋白或核酸，灵敏度高，背景低，检测灵敏度可达高飞克(femtogram)级，适用于检测痕量蛋白或核酸。发光信号持久，所采用的独特配方足以维持6小时以上的发光，便于反复曝光操作。与普通ECL化学发光底物相比，可明显减少一抗和二抗的使用量。

原理：超敏型ECL化学发光底物试剂盒用于检测直接或间接标记辣根过氧化物酶（HRP）的抗体、抗原或者核酸。蛋白质或核酸在电泳后转移到印迹膜上，以HRP标记的抗体或探针结合膜上的目的蛋白或核酸，洗膜后置于用本产品配制的ECL工作液中，室温孵育数分钟，HRP使工作液中的鲁米诺（Luminol）氧化并发光，试剂中添加的增强剂可以使得这种发光大大增强。此光经X光胶片或者电子装置感光记录下来，可清晰显示蛋白质或核酸条带。

超敏ECL化学发光示意图

使用方法：

1.印迹膜制备：执行常规电泳、转膜、HRP标记的抗体或者HRP标记的核酸探针孵育、洗膜；ECL工作液含有HRP催化的发光底物，检测系统必须基于HRP酶标记的抗体或者核酸探针。充分的洗涤对于降低背景非常重要，所有步骤均在室温下完成。

2.ECL工作液的配置：在使用前取等量A液和B液，混合均匀并尽快使用；将膜片置混合液中，于室温下孵育约1分钟，每平方厘米膜片至少使用0.1-0.2 ml以覆盖全膜片，注意不要在膜片表面形成气泡。

3.蛋白或核酸信号显现：

1).用平头镊钳住膜片，垂直置于吸水纸上以吸去过量试剂，仅留下少量液体覆盖表面，不可让膜完全干燥；

2).将膜片置于保鲜膜上，吸附蛋白面朝上，小心赶尽气泡；

3).用电子装置感光，或在暗室中用X光片曝光；

4).根据信号强弱适当调整曝光时间，也可选择不同时间多次曝光，以取得更佳效果。

应用^[4][5]

用于阻断肾上腺素能受体对人内皮细胞体外血管生成的影响研究

普萘洛尔、酚妥拉明抑制人微血管内皮细胞体外血管生成目的研究离体情况下,p-AR阻断剂普萘洛尔、a-AR阻断剂酚妥拉明对人微血管内皮细胞增殖、迁移、成管及VEGF、VEGFR-2、Ang1、Ang2、Tie-2表达的影响。

方法1.细胞免疫荧光鉴定内皮细胞：细胞采用免疫荧光染色Ⅷ因子进行鉴定。将人皮肤微血管内皮细胞和人脑微血管内皮细胞接种于24孔板爬片。待细胞融合至80%-90%时,4%冰多聚甲醛固定20分钟,0.2%Triton X-100通透10分钟,羊血清封闭30分钟。兔多克隆Ⅷ因子（vWF）一抗4℃湿盒内过夜。TRITC标记的羊抗兔二抗室温孵育2小时（避光）。Hochest（1μg/ml）染核15分钟（避光）后10%甘油封片。正置荧光显微镜下观察、拍片（×200倍）。

2. Western blot检测人微血管内皮细胞a-AR的表达：未经药物处理的人皮肤微血管内皮细胞和人脑微血管内皮细胞经裂解获得总蛋白。BCA定量,沸水灭活。取总蛋白约40μg进行SDS-PAGE凝胶电泳后,转移到PVDF膜上。5%BSA封闭1小时,蛋白样品分别在4℃冰箱孵育兔多克隆抗α1-AR、α2-AR一抗过夜。次日在37℃孵箱中孵育相应的二抗1h。采用超敏ECL化学发光试剂盒显色,于暗室内压片,显影定影。

3.细胞增殖实验：将人皮肤微血管内皮细胞种植于96孔板,将不同浓度梯度的普萘洛尔（0,25,50,75,100μM）、酚妥拉明（0,10,30,50,70μg/ml）分别处理细胞48h。然后每孔加入10μlCCK-8,孵箱中继续培养2h。之后于酶标仪测450nm下吸光度值。

参考文献

[1]Norepinephrine stimulates mobilization of endothelial progenitor cells after limb ischemia.Jiang QJ,Ding SF,Wu JX,et al.PLo S One.2014

[2]Increased tumor necrosis factor-α,cleaved caspase 3 levels and insulin receptor substrate-1 phosphorylation in theβ?-adrenergic receptor knockout mouse.Panjala Surekha Rani,Jiang Youde,Kern Timothy S,Thomas Steven A,Steinle Jena J.Molecular Vision.2011

[3]KIOM-79 protects AGE-induced retinal pericyte apoptosis via inhibition of NF-kappaB activation in vitro and in vivo.Kim Junghyun,Kim Chan-Sik,Sohn Eunjin,Lee Yun Mi,Jo Kyuhyung,Kim Jin Sook.PloS one.2012

[4]Propranolol for severe hemangiomas of infancy.Léauté-Labrèze Christine,Dumas de la Roque Eric,Hubiche Thomas,Boralevi Franck,Thambo Jean-Benot,Taeb Alain.The New England Quarterly.2008

[5]潘良利.阻断肾上腺素能受体对人内皮细胞体外血管生成的影响[D].南方医科大学,2016.