牛脂多糖结合蛋白(LBP)ELISA试剂盒的应用

背景^[1-3]

牛脂多糖结合蛋白(LBP)ELISA试剂盒可以用于检测样本中牛脂多糖结合蛋白(LBP)的含量。

原理：往预先包被牛脂多糖结合蛋白(LBP)捕获抗体的包被微孔中，依次加入标本、标准品、HRP标记的检测抗体，经过温育并彻底洗涤。用底物TMB显色，TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的牛脂多糖结合蛋白(LBP)呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），计算样品浓度。

牛脂多糖结合蛋白(LBP)

操作步骤

1.从室温平衡20min后的铝箔袋中取出所需板条，剩余板条用自封袋密封放回4℃。

2.设置标准品孔和样本孔，标准品孔各加不同浓度的标准品50μL；

3.样本孔中加入待测样本50μL；空白孔不加。

4.除空白孔外，标准品孔和样本孔中每孔加入辣根过氧化物酶（HRP）标记的检测抗体100μL，用封板膜封住反应孔，37℃水浴锅或恒温箱温育60min。

5.弃去液体，吸水纸上拍干，每孔加满洗涤液（350μL），静置1min，甩去洗涤液，吸水纸上拍干，如此重复洗板5次（也可用洗板机洗板）。

6.每孔加入底物A、B各50μL，37℃避光孵育15min。

每孔加入终止液50μL，15min内，在450nm波长处测定各孔的OD值。

应用^[4][5]

用于重组牛脂多糖结合蛋白对脂多糖诱导奶牛乳腺上皮细胞炎症反应的影响及其机制研究

通过原核表达,重组牛脂多糖结合蛋白（recombinant bovine lipopolysaccharide binding protein,rbLBP）和点突变脂多糖结合蛋白（rbM-LBP）。在乳腺上皮细胞体外培养基础上,利用脂多糖（LPS）诱导奶牛乳腺上皮细胞,建立了乳腺上皮细胞炎症反应模型。同时采用基因芯片技术对炎症反应模型差异表达基因进行分析,探讨了LPS诱导炎症反应的关键因子及信号通路。并进一步通过不同浓度的rbLBP及不同的LBP作用于炎症反应模型,探讨LBP影响炎症反应的作用及其分子机制,为LBP的应用及防治牛乳腺炎提供一定的参考依据。

方法：1.LBP载体制备、重组蛋白表达与纯化根据已知牛LBP基因序列及LBP第二外显子发生点突变的基因序列构建目的基因,并建立目的基因载体质粒pET22b,通过BL21大肠杆菌细胞为宿主的表达系统,IPTG诱导表达后纯化,得到高纯度的重组牛LBP蛋白和rbM-LBP蛋白,去除内毒素,通过免疫印迹分析鉴定重组蛋白。

结果表明,本试验成功构建了载体质粒pET22b（+）-LBP和pET22b（+）-rbM-LBP,通过BL21大肠杆菌细胞表达和纯化,得到高纯度的rbLBP蛋白和rbM-LBP蛋白。

2. 奶牛乳腺上皮细胞的优化培养及其炎症反应模型的建立选择健康中国荷斯坦牛,无菌采集乳腺组织,采用组织块接种法在DMEM培养液培养牛乳腺上皮细胞。细胞纯化后分别用β-酪蛋白和角蛋白鉴定。

结果表明,奶牛乳腺上皮细胞纯度在95%以上,符合试验要求。LPS作用于牛乳腺上皮细胞12h,10、20、100μg/mL浓度的LPS处理组IL-1β、TNF-α表达及分泌均显著上升,浓度在1～10Oμg/mL范围内LPS作用有剂量依赖性,100μg/mL LPS处理组可能因细胞毒性的作用,IL-1β、TNF-α的表达有略微下降,但仍然显著高于对照组（P<0.05）。

参考文献

[1]Lipopolysaccharide-binding protein as a major plasma protein responsible for endotoxemic shock.P Gallay,D Heumann,D Le Roy,C Barras,M P Glauser.Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America.1993

[2]Staphylococcus aureus and Escherichia coli elicit different innate immune responses from bovine mammary epithelial cells.Fu Y,Zhou E,Liu Z,et al.Veterinary Immunology and Immunopathology.2013

[3]NF-κB:A pleiotropic mediator of inducible and tissue-specific gene control.Michael J.Lenardo,David Baltimore.Cell.1989

[4]Differential production of cytokines,reactive oxygen and nitrogen by bovine macrophages and dendritic cells stimulated with Toll-like receptor agonists.Werling Dirk,Hope Jayne C,Howard Chris J,Jungi Thomas W.Immunology.2003

[5]孙宇.重组牛脂多糖结合蛋白对脂多糖诱导奶牛乳腺上皮细胞炎症反应的影响及其机制研究[D].南京农业大学,2015.