小鼠单核细胞趋化蛋白5(MCP-5) ELISA KIT的应用

背景^[1-3]

小鼠单核细胞趋化蛋白5(MCP-5)ELISA KIT可以用于体外检测不同样本中的小鼠单核细胞趋化蛋白5(MCP-5)的含量。

实验原理：用纯化的抗体包被微孔板，制成固相载体，往包被抗该指标抗体的微孔中依次加入标本或标准品、生物素化的抗该指标抗体、HRP标记的亲和素，经过彻底洗涤后用底物TMB显色。TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的该指标呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），计算样品浓度。

小鼠单核细胞趋化蛋白5(MCP-5) ELISA KIT

操作步骤：

1.加样：分别设空白孔、标准孔、待测样品孔。空白孔加样品稀释液100μl，余孔分别加标准品或待测样品100μl，注意不要有气泡，加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀，酶标板加上盖或覆膜，37℃反应120分钟。

为保证实验结果有效性，每次实验请使用新的标准品溶液。

2.弃去液体，甩干，不用洗涤。每孔加生物素标记抗体工作液100μl（取1μl生物素标记抗体加99μl生物素标记抗体稀释液的比例配制，轻轻混匀，在使用前一小时内配制），37℃,60分钟。

3.温育60分钟后，弃去孔内液体，甩干，洗板3次，每次浸泡1-2分钟，350μl/每孔，甩干。

4.每孔加辣根过氧化物酶标记亲和素工作液（同生物素标记抗体工作液）100μl，37℃，60分钟。

5.温育60分钟后，弃去孔内液体，甩干，洗板5次，每次浸泡1-2分钟，350μl/每孔，甩干。

6.依序每孔加底物溶液90μl，37℃避光显色（30分钟内，此时肉眼可见标准品的前3-4孔有明显的梯度蓝色，后3-4孔梯度不明显，即可终止）。

7.依序每孔加终止溶液50μl，终止反应（此时蓝色立转黄色）。终止液的加入顺序应尽量与底物液的加入顺序相同。为了保证实验结果的准确性，底物反应时间到后应尽快加入终止液。

8.用酶联仪在450nm波长依序测量各孔的光密度（OD值）。在加终止液后15分钟以内进行检测。

应用^[4][5]

用于miR-873调控IL-17诱导的小鼠星形胶质细胞产生炎症与趋化因子的机制研究

探讨IL-17体外刺激小鼠星形胶质细胞诱导某些炎性因子、趋化因子的生成和相关调控蛋白的表达以及体外、体内（EAE小鼠）微小RNA（microRNA，miRNA）表达谱的变化。

方法：体外培养的C57BL/6小鼠原代星形胶质细胞，用IL-17刺激（50ng/ml）后3h、6h、12h、24h和48h，行real-time PCR和ELISA方法检查小鼠星形胶质细胞合成白细胞介素-6（interleukin-6，IL-6）、肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）及巨噬细胞炎症蛋白-2（macrophageinflammatory protein-2，MIP-2）、单核细胞趋化蛋白-1（monocyte chemotacticprotein-1，MCP-1）和MCP-5的变化；同时用Western blot检查IL-17刺激星形胶质细胞后，上述各时间点A20（又称tumor necrosis factorαinducible protein3，TNFAIP3）及磷酸化的NF-B p65亚基（p-NF-B/p65）蛋白的表达水平。

此外，用miRNA芯片筛查IL-17刺激原代星形胶质细胞后3h、6h及EAE模型小鼠发病14d、20d时脑组织中miRNA表达谱的变化；并用Western blot和荧光素酶报告基因技术确证能调控A20表达的miRNAs。

参考文献

[1]Micro-RNA dysregulation in multiple sclerosis favours pro-inflammatory T-cell-mediated autoimmunity.[J].Guerau-de-Arellano Mireia,Smith Kristen M,Godlewski Jakub,Liu Yue,Winger Ryan,Lawler Sean E,Whitacre Caroline C,Racke Michael K,Lovett-Racke Amy E.Brain:a journal of neurology.2011(Pt 1)

[2]A20（TNFAIP3）deficiency in myeloid cells triggers erosive polyarthritis resembling rheumatoid arthritis.[J].Matmati Mourad,Jacques Peggy,Maelfait Jonathan,Verheugen Eveline,Kool Mirjam,Sze Mozes,Geboes Lies,Louagie Els,Mc Guire Conor,Vereecke Lars,Chu Yuanyuan,Boon Louis,Staelens Steven,Matthys Patrick,Lambrecht Bart N,Schmidt-Supprian Marc,Pasparakis Manolis,Elewaut Dirk,Beyaert Rudi,van Loo Geert.Nature genetics.2011(9)

[3]Identification of miR-193b targets in breast cancer cells and systems biological analysis of their functional impact.[J].Leivonen Suvi-Katri,Rokka Anne,Ostling P?ivi,Kohonen Pekka,Corthals Garry L,Kallioniemi Olli,Per?l?Merja.Molecular&cellular proteomics:MCP.2011(7)

[4]The Ubiquitin-Editing Protein A20 Prevents Dendritic Cell Activation,Recognition of Apoptotic Cells,and Systemic Autoimmunity[J].Mirjam Kool,Geert van Loo,Wim Waelput,Sofie De Prijck,Femke Muskens,Mozes Sze,Jens van Praet,Filipe Branco-Madeira,Sophie Janssens,Boris Reizis,Dirk Elewaut,Rudi Beyaert,Hamida Hammad,Bart N.Lambrecht.Immunity.2011(1)

[5]刘晓梅.miR-873调控IL-17诱导的小鼠星形胶质细胞产生炎症与趋化因子的机制研究[D].南京医科大学,2012.