HFTF人胚胎眼TENON'S囊成纤维细胞的应用

背景^[1-3]

HFTF人胚胎眼TENON'S囊成纤维细胞分离自人胚胎眼TENON'S囊纤维膜的成纤维细胞，主要用于人胚胎眼TENON'S囊成纤维细胞的体外研究。

TENON'S囊又称眼球筋膜鞘（fascial sheath of eyeball），指眶脂体与眼球之间的薄而致密的纤维膜。眼球筋膜鞘包绕眼球大部分,向前在角膜缘稍后方与巩膜融合在一起,向后与视神经硬鞘膜结合。

HFTF人胚胎眼TENON'S囊成纤维细胞

HFTF人胚胎眼Tenon's囊成纤维细胞价格培养步骤：

1）复苏细胞：将含有1mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加入5mL培养基混合均匀。在1000RPM条件下离心5分钟，弃去上清液，补加4-6mL完全培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入培养瓶中培养过夜（或将细胞悬液加入6cm皿中），培养过夜。第二天换液并检查细胞密度。

2）细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。

1.弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。

2.加1-2ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培养瓶中，置于37℃培养箱中消化1-2min，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加5ml以上含10%血清的完全培养基终止消化。

3.轻轻吹打细胞，完全脱落后吸出，在1000RPM条件下离心8-10分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养液后吹匀。

4.按5-6ml/瓶补加培养液，将细胞悬液按1：2到1：5的比例分到新的含5-6 ml培养液的新皿中或者瓶中。

应用^[4][5]

用于慢病毒介导DR5嵌合抗体表达及其抗肿瘤活性研究

H2AL成功地克隆到慢病毒载体pWPXL后,转染人胚肾细胞HEK293,发现该重组抗体（Zaptuzumab）可以高表达并分泌到细胞培养液中,其与人DR5结合的亲和力常数Km为0.5nM；

细胞培养液中的Zaptuzumab对HCT116结肠癌等6种肿瘤细胞株具有显著的杀伤作用,其信号转导通路为Caspase依赖的胞外信号凋亡通路和线粒体依赖的凋亡通路,但对正常人胚胎眼Tenon’s囊成纤维细胞基本无毒性；重组慢病毒载体包装和纯化后,获得了滴度为109TU/ml的重组慢病毒颗粒（Lenti-H2AL）,该重组病毒感染HEK293细胞后,获得了可稳定表达Zaptuzumab的细胞株,细胞培养液中分泌的Zaptuzumab嵌合抗体浓度达12±0.7μg/ml;

该重组病毒感染SMMC7721肝癌、肺腺癌等10种肿瘤细胞株72小时后,肿瘤细胞存活率为7.36-92.73%,对多种肿瘤细胞株具有显著的细胞毒作用；

将感染了该重组病毒的HCT116细胞接种到BALB/c裸鼠皮下,观察移植瘤形成和生长情况,发现实验组肿瘤体积仅为对照组的10%,表明该重组病毒感染具有显著抑制肿瘤形成和生长的能力；

在移植瘤组织及荷瘤动物外周血中检测到Zaptuzumab表达,分别达到890ng/mg和1000ng/ml;

建立A549肺原位癌动物模型,经肌肉单独注射该重组病毒或与尾静脉注射丝裂霉素（MMC）联合给药,分别可延长肺原位瘤小鼠的生存期（P<0.01）；

以白介素-2活化的人外周血单.个核细胞（PBMC）作为效应细胞,以对Zaptuzumab敏感性较低的A549细胞为靶细胞,以健康人的血清为补体来源,研究Zaptuzumab抗体依赖的细胞杀伤效应（ADCC）和补体依赖的细胞毒（CDC）作用,发现在Zaptuzumab的浓度为6μg/ml、效靶细胞比为25时,A549细胞的存活率降低了38%。

在Zaptuzumab的浓度为3μg/ml和有人血清补体存在时,A549的存活率降低了40%,提示慢病毒介导Zaptuzumab表达除可以诱导肿瘤细胞凋亡外,还可以激活抗体依赖的和补体依赖的细胞杀伤效应。

参考文献

[1]Glial cell line‐derived neurotrophic factor–secreting genetically modified human bone marrow‐derived mesenchymal stem cells promote recovery in a rat model of Parkinson’s disease[J].AleksandraGlavaski‐Joksimovic,TamasVirag,Thomas A.Mangatu,MichaelMcGrogan,Xue SongWang,Martha C.Bohn.J.Neurosci.Res..2010(12)

[2]Human mesenchymal stem cell transplantation protects against cerebral ischemic injury and upregulates interleukin-10 expression in Macaca fascicularis[J].Jiamei Li,Hua Zhu,Ying Liu,Qin Li,Shan Lu,Ming Feng,Yanfeng Xu,Lan Huang,Chunmei Ma,Yihua An,Robert Chunhua Zhao,Renzhi Wang,Chuan Qin.Brain Research.2010

[3]Therapeutic potential of adult bone marrow‐derived mesenchymal stem cells in diseases of the skeleton[J].DiptimanChanda,SanjayKumar,SelvaranganPonnazhagan.J.Cell.Biochem..2010(2)

[4]Growth inhibition of colorectal carcinoma by lentiviral TRAIL‐transgenic human mesenchymal stem cells requires their substantial intratumoral presence[J].JanaLuetzkendorf,Lutz P.Mueller,ThomasMueller,HenrikeCaysa,KatrinNerger,Hans‐JoachimSchmoll.Journal of Cellular and Molecular Medicine.2009(9)

[5]李蒙.慢病毒介导DR5嵌合抗体表达及其抗肿瘤活性研究[D].北京协和医学院,2010.