NH-6 人肾上腺神经母细胞瘤细胞系的应用

背景^[1-3]

NH-6人肾上腺神经母细胞瘤细胞系来源于一位男性骨髓转移肾上腺神经母细胞瘤组织，主要用人肾上腺神经母细胞瘤细胞的体外研究。

人肾上腺神经母细胞瘤来自交感神经系统，主要为肾上腺或交感神经节的原始细胞的恶性肿瘤。为婴儿和儿童中仅次于白血病的最常见的恶性中枢神经系统肿瘤。身体各个部位均可发生，肾上腺与颈、胸、腹交感神经节为常见部位。

NH-6人肾上腺神经母细胞瘤细胞

神经母细胞瘤（NB）从原始神经嵴细胞演化而来，交感神经链、肾上腺髓质是最常见的原发部位。不同年龄、肿瘤发生部位及不同的组织分化程度使其生物特性及临床表现有很大差异，部分可自然消退或转化成良性肿瘤，但另一部分患儿却又十分难治，预后不良。

对NB敏感的药物有环磷酰胺、长春新碱、依托泊苷（VP-16）、卡铂、顺铂、抗肿瘤抗生素（多柔比星）、异环酰胺等，各个协作组采用不同药物组合对晚期患儿强化疗，但预后改善仍未令人满意。

复苏细胞：将含有1mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加入5mL培养基混合均匀。在1000RPM条件下离心5分钟，弃去上清液，补加4-6mL完全培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入培养瓶中培养过夜（或将细胞悬液加入6cm皿中），培养过夜。第二天换液并检查细胞密度。

传代方法：

1.弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。

2.加1-2ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培养瓶中，置于37℃培养箱中消化1-2min，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加5ml以上含10%血清的完全培养基终止消化。

3.轻轻吹打细胞，完全脱落后吸出，在1000RPM条件下离心8-10分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养液后吹匀。

4.按5-6ml/瓶补加培养液，将细胞悬液按1：2到1：5的比例分到新的含5-6 ml培养液的新皿中或者瓶中。

应用^[4][5]

用于裸鼠皮下移植人神经母细胞瘤模型的建立和HIF-1α及其相关蛋白的表达研究

利用人肾上腺神经母细胞瘤细胞株建立裸鼠皮下移植人神经母细胞瘤模型,并探讨神经母细胞瘤中HIF-1α、VEGF、TGF-α等的表达情况,了解他们在肿瘤与正常组织中表达的差异。

方法应用KP-N-NS人肾上腺神经母细胞瘤细胞株建立裸小鼠皮下移植瘤模型40只,作为肿瘤组；阳性对照组选取手术切除的神经母细胞瘤肿瘤标本；阴性对照组选取正常人肾上腺髓质组织。

采用Envision免疫组织化学方法检测各组组织中HIF-1α、VEGF及TGF-α的表达情况,并对试验结果进行统计学处理。结合免疫组化结果将肿瘤组分为HIF-1α阳性组与HIF-1α阴性组,对两组的生存情况（体重变化、瘤体重量、存活天数）进行比较,并对试验结果进行统计学处理。

结果4周后解剖结果证实成模率80%；HIF-1α及其相关蛋白的阳性表达均主要表现为细胞核及细胞质内棕黄色颗粒；肿瘤组、阳性对照组与正常组HIF-1α、VEGF、TGF-α阳性表达率分别为73.70%±10.68%、69.80%±9.91%、71.43%±8.52%,70.35%±13.09%、67.45%±9.91%、70.30%±9.86%和9.67%±4.53%、6.80%±3.40%、6.50%±4.44%,三种蛋白在肿瘤组织与正常组织中的表达差异具有显著性（P<0.01）,肿瘤组与阳性对照组HIF-1α,VEGF、TGF-α三种蛋白的IOD（阳性染色的积分光密度）值分别为141.97±7.98、151.85±14.35、139.94±4.50,141.34±6.44、144.06±8.51、149.00±13.63,均明显高于阴性对照组,p<0.0l。

HIF-lα在肿瘤组与阳性对照组中的表达与VEGF的表达成正相关（χ2=7.778r=0.504 P<0.01）,HIF-1α在肿瘤组与阳性对照组中的表达与TGF-α的表达无明显相关性（χ2=0.208 P=0.934 P>0.05）；HIF-1α阳性组与HIF-1α阴性组体重变化、瘤体重量及存活天数比较t值分别为：-3.43、3.69、4.30,P值均小于0.01。

参考文献

[1]Regulation of angiogenesis by hypoxia-inducible factor 1[J].Kiichi Hirota,Gregg L.Semenza.Critical Reviews in Oncology and Hematology.2006(1)

[2]A Radicicol Derivative,KF58333,Inhibits Expression of Hypoxia‐inducible Factor‐1αand Vascular Endothelial Growth Factor,Angiogenesis and Growth of Human Breast Cancer Xenografts[J].JunichiKurebayashi,TakemiOtsuki,MasafumiKurosumi,ShiroSoga,ShiroAkinaga,HiroshiSonoo.Cancer Science.2005(12)

[3]Pleiotropic effects of HIF-1 blockade on tumor radiosensitivity[J].Benjamin J.Moeller,Matthew R.Dreher,Zahid N.Rabbani,Thies Schroeder,Yiting Cao,Chuan Y.Li,Mark W.Dewhirst.Cancer Cell.2005(2)

[4]Guidelines for surgical treatment of hepatoblastoma in the modern era–Recommendations from the Childhood Liver Tumour Strategy Group of the International Society of Paediatric Oncology（SIOPEL）[J].Piotr Czauderna,Jean Bernard Otte,Daniel C.Aronson,Frederic Gauthier,Gordon Mackinlay,Derek Roebuck,Jack Plaschkes,Giorgio Perilongo.European Journal of Cancer.2005(7)

[5]孟庆磊.裸鼠皮下移植人神经母细胞瘤模型的建立和HIF-1α及其相关蛋白的表达[D].郑州大学,2011.