HSC-T6 大鼠肝星形细胞系的应用

背景^[1-3]

HSC-T6大鼠肝星形细胞系是分离自SD大鼠肝脏组织的成熟上皮细胞样 贴壁细胞，主要用于HSC-T6大鼠肝星形细胞的体外研究。

选用SD大鼠经消化酶灌注肝脏后,用调整密度后的淋巴细胞分离液分离HSC.通过观察其自发荧光及显著其特征性结构的脂肪染色,细胞免疫化学染色等方法鉴定。

HSC-T6大鼠肝星形细胞

大鼠肝星形细胞根据胶质丝的含量以及胞突的形状可将星形胶质细胞分为两种：

纤维性(大鼠肝星形细胞)星形胶质细胞（fibrous astrocyte）多分布在脑脊髓的皮质，突起细长，分支较少，胞质中含大量胶质丝，又称蜘蛛细胞（spider cell）；

原浆性星形胶质细胞（protoplasmic astrocyte），多分布在灰质，细胞突起粗短，分支多。胞质内胶质丝较少，又称苔状细胞（mossycell）。

电镜下(大鼠肝星形细胞)星形胶质细胞的胞核有缺失，胞质较清亮，游离核糖核蛋白体和粗面内质网均很少，糖原颗粒丰富，有大量的胶质丝。纤维形星形胶质细胞的突起呈长圆柱形，而原浆性星形胶质细胞的突起呈薄片状，并常包裹着神经细胞及其突触（不伸入突触间隙）。星形胶质细胞的脚板与血管内皮细胞之间相隔一层基板，脚板质膜与基板接触处有半桥粒结构。

应用^[4][5]

用于血管紧张素Ⅱ受体1结合蛋白（ATRAP）在大鼠肝星形细胞（HSC-T6）中的表达及其在局部肾素血管紧张素系统中的作用研究

利用大鼠永生化肝星形细胞株（HSC-T6）作为研究对象,利用实时荧光定量反转录聚合酶连锁反应（qRT-PCR）技术及Western blot技术检测正常状态下生长的HSC-T6细胞中是否存在ATRAP的表达,并通过改变HSC-T6局部RAS的成分,破坏其平衡,即分别加入AngⅡ及Ang（1-7）对细胞株进行刺激,探讨ATRAP与局部肾素血管紧张素系统中ACE-AngⅡ-AT1受体轴、ACE2-Ang（1-7）-Mas受体轴之间可能存在的关系,即ATRAP在局部RAS中的调节作用。

方法：1、大鼠肝星形细胞（HSC-T6）的培养及处理前准备：在37℃、体积分数5%的C02条件下,将HSC-T6培养于含10%胎牛血清、100U/mL青霉素、100μg/mL链霉素的DMEM高糖培养基中,每日观察其细胞形态和生长状况,每周传代2次。进行细胞干预实验前,将细胞传代至6孔板中,以约4×105cells/mL的细胞密度,集中1mL细胞,其后补加1mL培养基,轻摇使细胞均匀分散,其后至于C02培养箱中培养。

待细胞贴壁后,更换培养基为含有1μmol/L各实验药物的培养基,对照组仍为完全培养基,处理后继续培养箱中培养。

2、用浓度为1μmol/L的药物AngⅡ对HSC-T6进行单次小剂量刺激处理,刺激后继续培养箱中培养,分别在刺激后2小时、6小时、12小时、18小时、24小时以及36小时等6个时间点收集细胞,利用实时荧光定量反转录聚合酶连锁反应（qRT-PCR）检测HSC-T6在以上各时间点目的基因ATRAP、血管紧张素Ⅱ受体1（AT1R）、Mas受体以及血管紧张素转换酶2（ACE2）等mRNA的表达水平,利用Western blot技术检测上述各时间点,各目的基因的蛋白质表达水平。

参考文献

[1]Effects of renin-angiotensin system blockade on renal angiotensin-（1-7）forming enzymes and receptors.Ferrario Carlos M,Jessup Jewell,Gallagher Patricia E,Averill David B,Brosnihan K Bridget,Ann Tallant E,Smith Ronald D,Chappell Mark C.Kidney International.2005

[2]Reversal of hepatic fibrosis-fact or fantasy?.Friedman SL,Bansal MB.Hepatology.2006

[3]Cloning and characterization of ATRAP,a novel protein that interacts with the angiotensin II type 1 receptor.Daviet L,Lehtonen J Y,Tamura K,Griese D P,Horiuchi M,Dzau V J.Journal of Biological Chemistry.1999

[4]Direct stimulation of Jak/STAT pathway by the angiotensin II AT1 receptor.Marrero M B,Schieffer B,Paxton W G,Heerdt L,Berk B C,Delafontaine P,Bernstein K E.Nature.1995

[5]黄海洋.血管紧张素Ⅱ受体1结合蛋白（ATRAP）在大鼠肝星形细胞（HSC-T6）中的表达及其在局部肾素血管紧张素系统中的作用[D].南方医科大学,2014.