DI TNC1 大鼠脑间质细胞系的应用

背景^[1-3]

DI TNC1大鼠脑间质细胞系是分离自大鼠脑组织的一类间质细胞系，主要用于体外脑间质细胞的相关研究。

间质细胞是这个器官内存在的那些辅助实质细胞完成器官功能的细胞，呈多角形或圆形，体积大，核呈圆形。比如脑内的神经元就是实质细胞，神经胶质细胞起支持营养神经细胞的作用，算是一种间质细胞，再如肝脏细胞是实质细胞，肝小叶间的纤维细胞就是间质细胞，起支持作用。

DI TNC1大鼠脑间质细胞

细胞培养步骤:

培养基及培养冻存条件准备：

1）准备基础培养基(GIBCO，，添加NaHCO3 1.5g/L，丙酮酸钠0.11g/L)；优质胎牛血清，10%。

2）培养条件：气相：空气，95%；二氧化碳，5%。温度：37摄氏度，培养箱湿度为70%-80%。

3）冻存液：90%完全培养基，10%DMSO，现用现配。液氮储存。

细胞处理：

1）复苏细胞：将含有1mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加入4mL培养基混合均匀。在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入培养瓶中培养过夜（或将细胞悬液加入250px皿中，加入约8ml培养基，培养过夜）。第二天换液并检查细胞密度。

2）细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。

3）细胞冻存：待细胞生长状态良好时，可进行细胞冻存。贴壁细胞冻存时，弃去培养基后加入少量胰酶，细胞变圆脱落后，加入约1ml含血清的培养基后加入冻存管中，再添加10%DMSO后进行冻存。

应用^[4][5]

用于重组人白细胞介素10基因慢病毒载体的构建及其镇痛效应的研究

构建含人白细胞介素10基因的重组慢病毒载体LV／hIL-10，观察LV／hIL-10对激活的星形胶质细胞的干预作用及其对慢性疼痛模型大鼠（chronic constriction injury，CCI）的镇痛效应，初步探讨HMGB1是否参与了CCI大鼠的痛敏维持。

方法1．合成引物，以pCYIL-10质粒为模板，PCR扩增出hIL-10基因，并重组到质粒pWPXL-GFP，酶切、测序鉴定正确后，将重组质粒pWPXL-hIL-10与包膜质粒pMD2．G、包装质粒psPAX2共转染到293T细胞，包装出复制缺陷的慢病毒颗粒，进行病毒滴度的测定。

2．将DI TNCI（大鼠大脑皮质组织来源的星形胶质细胞株）细胞培养分瓶后，用不同浓度（0、250、500、750、1000ng／IIlL）大肠杆菌的LPS作用于DI TNC1 8h后，ELISA测定促炎因子TNF-α、IL-1β的分泌。500ng／ml LPS作用于DI TNC1不同时间后，PT-PCR测定TNF-α、IL-1β和晚期炎症介质高迁移率族蛋白-1（High MobilityGroup Box1，HMGB1）的mRNA表达，ELISA测定TNF-α、IL-1β的分泌，Western Blot测定HMGB1的蛋白表达。

LV／hIL-10、LV-GFP瞬时转染DI TNC1，4h后检测IL-10的mRNA表达和蛋白分泌，LV／hIL-10、LV-GFP转染LPS所致DI TNC1细胞后，分别测定各时点TNF-α、IL-1β和HMGB1 mRNA的表达及其分泌。

参考文献

[1]Preversus postformlin effects of ketamine or large-dose alfentanil in the rat:discordance between pain behavior and spinal Fos-like immunoreactivity.Gilron I,Quirion R,Codere TJ,et al.Anesthesia and Analgesia.1999

[2]Kinecticanal-yses of stability of simple and complex retroviral vectors.HigashikawaF,ChangL.Journal of Virology.2001

[3]Nerve growth factor in glia and inflammatory cells of the injured rat spinal cord.Krenz NR,Weaver LC.Journal of Neurochemistry.2000

[4]Activity-dependent neuronalcontrol of gap-junctional communication in astrocytes.Rouach N,Glowinski J,Giaume C.Journal of Cell Biology,The.2000

[5]贺正华.重组人白细胞介素10基因慢病毒载体的构建及其镇痛效应的研究[D].中南大学,2007.