RED BLOOD CELL LYSIS BUFFER 红细胞裂解液的应用

背景^[1-3]

RED BLOOD CELL LYSIS BUFFER红细胞裂解液是一种去除红细胞最简便易行的方法，即用裂解液裂解红细胞，它既不损伤有核细胞又能充分的去除红细胞。裂解液裂解是一种比较温和的红细胞去除方法，主要用于经酶消化分散的组织细胞的分离纯化，淋巴细胞的分离纯化以及组织细胞蛋白与核酸提取等实验中红细胞的去除。

红细胞裂解

经红细胞裂解液裂解得到的组织细胞中不含红细胞，可进一步用于原代培养、细胞融合、流式细胞分析、核酸与蛋白的分离和提取等。

氯化铵是红细胞裂解液的主要效应物质，氨根离子不能通过细胞膜，而其他离子可以通过，造成细胞内外的离子浓度差异，形成了渗透压差，外部的水分会扩散至细胞内，使红细胞膨胀，达到裂解的效果。

使用步骤：

1.新鲜抗凝血，离心弃去上清液；

2.取出4℃冰箱预冷的ELS裂解液，按1:6-10的比例向细胞沉淀中加入ELS裂解液（1ml细胞压积加入6-10ml裂解液），轻轻吹打混匀；

3.800-1000rpm离心5-8分钟，离心弃去上层红色清液；

4.收集沉淀部分，加入Hank’s液或无血清培养液离心洗2-3次；

5.如裂解不完全可重复步骤2和3；

6.重悬细胞，用于后续实验；如提取RNA，是于步骤4开始使用DEPC水配制的溶液进行。

应用^[4][5]

用于红细胞内血红蛋白相互作用的研究

免疫共沉淀联合血红蛋白释放实验研究红细胞内血红蛋白的相互作用目的将红细胞血红蛋白电泳释放实验（Hemoglobin release test,HRT）与免疫共沉淀联用,寻找红细胞内与血红蛋白（Hemoglobin,Hb）相互作用的蛋白。

方法：首先将正常成人新鲜抗凝全血制备成红细胞悬液和溶血液,通过血红蛋白电泳释放实验分别分离得到红细胞HbA（RA）、红细胞HbA2（RA2）,溶血液HbA（HA）和溶血液HbA2（HA2）。

将此区带从凝胶中分别切出,经过反复冻融后,将上清吸出并进行浓缩,然后分别用hemoglobinβantibody通过免疫共沉淀的方法分别从红细胞裂解液、RA和HA中捕获血红蛋白相互作用的蛋白复合物,并用5%-12%的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳对此复合物进行分离,最后用Q-TOF MS对目的区带进行鉴定,并用IDQD模型对血红蛋白相互作用进行预测,之后利用免疫印迹对质谱和IDQD预测结果进行验证。

结果经5%-12%SDS-PAGE分离,红细胞裂解液,RA和HA的免疫共沉淀复合物中主要包含16 k D、20 k D、22 k D、28 k D和50 k D五条明显的区带,经质谱鉴定可信度较高的蛋白为16 k D的血红蛋白和22 k D的硫氧还蛋白过氧化物酶2（peroxiredoxin2,Prx2）,IDQD模型预测HbA与Prx2之间存在相互作用,而HbA2与Prx2之间不存在相互作用。

通过免疫印迹证明在RA、HA和RA2中确实有Prx 2存在,而在HA2中没有检测到Prx2。结论在人红细胞内,Prx2与HbA之间存在相互作用,但与HbA2之间没有相互作用。

参考文献

[1]The novel role of peroxiredoxin-2 in red cell membrane protein homeostasis and senescence[J].Alessandro Matté,Antonella Pantaleo,Emanuela Ferru,Franco Turrini,Mariarita Bertoldi,Francesca Lupo,Angela Siciliano,Chae Ho Zoon,Lucia De Franceschi.Free Radical Biology and Medicine.2014

[2]Hydrogen peroxide metabolism and sensing in human erythrocytes:A validated kinetic model and reappraisal of the role of peroxiredoxin II[J].Rui Benfeitas,Gianluca Selvaggio,Fernando Antunes,Pedro M.B.M.Coelho,Armindo Salvador.Free Radical Biology and Medicine.2014

[3]Challenges for red blood cell biomarker discovery through proteomics[J].Benjamin Barasa,Monique Slijper.BBA-Proteins and Proteomics.2014(5)

[4]Contribution of membrane permeability and unstirred layer diffusion to nitric oxide–red blood cell interaction[J].Prabhakar Deonikar,Mahendra Kavdia.Journal of Theoretical Biology.2013

[5]安亮.红细胞内血红蛋白相互作用的研究[D].内蒙古科技大学包头医学院,2015.