MLE-12小鼠肺上皮细胞的应用

背景^[1-3]

MLE-12小鼠肺上皮细胞 是由Kathryn A.Wikenheiser于1992年在转基因鼠体内建立，通过人表面活性蛋白C基因启动子区调控的SV40大T抗原在小鼠体内形成肺肿瘤。细胞抗原表达: HLA A11,B15,B17,Cw1,Cw3;blood type B，细胞致癌基因：myc+;myb+;ras+;fos+;p53+;sis-;abl-;ros-;src-细胞基因表达: 肺表面活性物质蛋白B和C（SP-B，SP-C），而且该细胞能够诱导癌细胞产生。

MLE-12小鼠肺上皮细胞

小鼠肺上皮细胞株培养操作

1）复苏细胞：将含有1mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加入4mL培养基混合均匀。在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入培养瓶中培养过夜（或将细胞悬液加入10cm皿中，加入约8ml培养基，培养过夜）。第二天换液并检查细胞密度。

2）细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。

1.弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。

2.加1ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培养瓶中，置于37℃培养箱中消化1-2分钟，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加少量培养基终止消化。

3.按6-8ml/瓶补加培养基，轻轻打匀后吸出，在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养液后吹匀。

4.将细胞悬液按1：2比例分到新的含8ml培养基的新皿中或者瓶中。

应用^[4][5]

用于蛋白酪氨酸磷酸酶Shp2在香烟诱导肺纤维化中的调节作用研究

探讨抑制和基因敲除Shp2减轻吸烟诱导小鼠肺纤维化的作用及机制。

方法：1、整体实验：观察Shp2特异性抑制剂PHPS1干预和肺上皮细胞Shp2基因敲除小鼠对吸烟引起的肺纤维化指标的影响。小鼠每天吸烟10支,连续10天,诱导肺纤维化模型,检测指标包括转录生长因子β1（Transforming growth factor-β1,TGF-β1）、基质金属蛋白酶-9（Matrix metalloproleinase-9,MMP-9）、钙结合蛋白（Calcium binding protein,S100A4）,胶原纤维沉积以及Shp2表达。

1) 收集肺泡灌洗液（BALF）,采用酶联免疫吸附（Elisa）法检测BALF上清中MMP-9和TGF-β1蛋白表达；

2) 收集肺组织,制备匀浆上清液,采用定量多聚合酶链反应（Q-PCR）法测定匀浆上清液中MMPs和TGF-β1基因的表达；

3) 制作肺组织切片,采用免疫组化染色法检测小气道周围Shp2、MMP-9和S100A4表达；

4) 肺组织切片,采用Masson胶原纤维染色法检测小气道周围胶原纤维沉积。

2、离体实验：观察Shp2特异性抑制剂PHPS1处理肺上皮细胞和Shp2基因沉默肺上皮细胞对CSE诱导的MMP-9和TGF-β1表达的影响,以及对信号分子的影响。香烟烟雾提取物（CSE）刺激小鼠正常肺上皮细胞MLE-12：

1) 采用MTT法测定MLE-12细胞活性；

2) Western blot（WB）法检测CSE诱导p-Shp2和Shp2表达；

3) CSE刺激MLE-12细胞,Q-PCR法检测MMPs基因表达,WB法检测MMP-9蛋白表达；

4) Shp2特异性抑制剂PHPS1干预细胞后进行CSE刺激,采用Q-PCR和WB法检测Shp2对CSE诱导MMP-9基因和蛋白的影响；

参考文献

[1]Tackling a Root Cause of Chronic Lung Disease The ATS,FDA,and Tobacco Control.Mary Ellen Wewers,Alfred Munzer,Gary Ewart.American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine.2010

[2]Reduced peribronchial fibrosis in allergen-challenged MMP-9-deficient mice.Lim Dae Hyun,Cho Jae Youn,Miller Marina,McElwain Kirsti,McElwain Shauna,Broide David H.American journal of physiology.Lung cellular and molecular physiology.2006

[3]Trends in the leading causes of death in the United States,1970-2002.Jemal Ahmedin,Ward Elizabeth,Hao Yongping,Thun Michael.JAMA:the journal of the American Medical Association.2005

[4]Natural history of emphysema.Minai Omar A,Benditt Joshua,Martinez Fernando J.Proceedings of the American Thoracic Society.2008

[5]刘亚楠.蛋白酪氨酸磷酸酶Shp2在香烟诱导肺纤维化中的调节作用[D].扬州大学,2014.