大鼠小肠成纤维细胞的应用

背景^[1-3]

大鼠小肠成纤维细胞来源于实验动物的正常小肠组织，纤维连接蛋白（Fibronectin）或波形蛋白（Vimentin）免疫荧光染色为阳性。不含有HIV-1、HBV、HCV、支原体、细菌、酵母和真菌，细胞生长方式：长梭状细胞，贴壁培养。

大鼠小肠成纤维细胞

小肠位于腹中，上端接幽门与胃相通，下端通过阑门与大肠相连。小肠与心互为表里。是食物消化吸收的主要场所，盘曲于腹腔内，上连胃幽门，下接盲肠，全长约5－6米，张开有半个篮球大，分为十二指肠、空肠和回肠三部分。其管壁外围有结缔组织，这些结缔组织由成纤维细胞构成，对小肠起到支持和保护作用。

大鼠小肠成纤维细胞培养操作

1）复苏细胞：将含有1mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加入4mL培养基混合均匀。在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入培养瓶中培养过夜（或将细胞悬液加入10cm皿中，加入约8ml培养基，培养过夜）。第二天换液并检查细胞密度。

2）细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。

1.弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。

2.加1ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培养瓶中，置于37℃培养箱中消化1-2分钟，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加少量培养基终止消化。

3.按6-8ml/瓶补加培养基，轻轻打匀后吸出，在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养液后吹匀。

4.将细胞悬液按1：2比例分到新的含8ml培养基的新皿中或者瓶中。

应用^[4][5]

用于基于成纤维细胞的经络作用机制的探索研究

从成纤维细胞出发,通过对其与活性氧、胞外基质中的Ⅰ型胶原蛋白以及结缔组织中另一重要细胞组分——肥大细胞之间相互关系的初步研究。

（1）体内实验:选取大鼠腹白线（解剖学上与任脉重合的结缔组织）为主要研究对象,对比其他组织的活性氧相关生化指标,分析腹白线的活性氧水平;对大鼠进行尾静脉注射过氧化氢、谷胱甘肽或生理盐水,通过WestemBlot分析不同活性氧水平对ERK信号通路的影响。

（2）体外实验:选择构建体外活性氧引发体系,并确定其主要作用部位是在胞内或胞外;通过单独培养与共培养的细胞体系,探究成纤维细胞（L929）与活性氧、Ⅰ型胶原蛋白和肥大细胞（P815）之间的相互作用,以及经络中含量较高的钙离子对单独培养和共培养体系中胞内活性氧浓度及细胞存活情况的影响。

结果:（1）体内实验:确认腹白线中活性氧浓度相对较高,其中的细胞处于较高的氧化胁迫强度的环境中;而活性氧过氧化氢、抗氧化剂还原型谷胱甘肽分别对结缔组织ERK信号通路产生极显著的下调、上调作用。

（2）体外实验:L929细胞的存活率在活性氧浓度较低时相对稳定。Ⅰ型胶原蛋白促进结缔组织成纤维细胞L929的增殖,且在其遭受胞外活性氧攻击时有一定的保护作用;肥大细胞P815促进L929细胞分泌Ⅰ型胶原蛋白且能改变其细胞形态;胞外活性氧对1型胶原蛋白以破坏作用为主,而胞内活性氧会促进L929细胞分泌!型胶原蛋白;活性氧对L929细胞形态的改变在一定程度上是可逆的;培养基中的钙离子会影响胞内活性氧水平,较低浓度的钙离子内流对细胞的增殖有益,且因其能影响肥大细胞脱颗粒,故还能通过此作用间接影响L929细胞。

参考文献

[1]Mucosal stromal fibroblasts markedly enhance HIV infection of CD4+T cells[J].Jason A.Neidleman,Joseph C.Chen,Nargis Kohgadai,Janis A.Müller,Anders Laustsen,Karthiga Thavachelvam,Karen S.Jang,Christina M.Stürzel,Jennifer J.Jones,Christina Ochsenbauer,Avantika Chitre,Ma Somsouk,Maurice M.Garcia,James F.Smith,Ruth M.Greenblatt,Jan Münch,Martin R.Jakobsen,Linda C.Giudice,Warner C.Greene,Nadia R.Roan.PLOS Pathogens.2017(2)

[2]Cellular control of connective tissue matrix tension[J].Helene M.Langevin,Maiken Nedergaard,Alan K.Howe.J.Cell.Biochem..2013(8)

[3]Fibroblast cytoskeletal remodeling induced by tissue stretch involves ATP signaling[J].Helene M.Langevin,Takumi Fujita,Nicole A.Bouffard,Takahiro Takano,Cathryn Koptiuch,Gary J.Badger,Maiken Nedergaard.J.Cell.Physiol..2013(9)

[4]Fibrocytes:emerging effector cells in chronic inflammation[J].Hong Peng,Erica L Herzog.Current Opinion in Pharmacology.2012(4)

[5]林靖颖.基于成纤维细胞的经络作用机制的探索研究[D].福州大学,2017.