ATDC5小鼠胚胎瘤细胞的应用

背景^[1-3]

ATDC5小鼠胚胎瘤细胞是来源于畸胎瘤细胞的小鼠软骨发生细胞系，在胰岛素刺激下，分化成软骨细胞，形成软骨小结，表达Ⅱ型胶原和X型胶原最后发生矿化，反映软骨发生过程。

ATDC5小鼠胚胎瘤细胞

细胞培养步骤

培养基及培养冻存条件准备：

1）准备DMEM培养基(DMEM，GIBCO，货号11965-092)，90%；胎牛血清，10%。

2）培养条件：气相：空气，95%；二氧化碳，5%。温度：37摄氏度，培养箱湿度为70%-80%。

3）冻存液：90%完全培养基，10%DMSO，现用现配。液氮储存。

细胞处理：

1）复苏细胞：将含有1mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加入4mL培养基混合均匀。在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入培养瓶中培养过夜（或将细胞悬液加入10cm皿中，加入约8ml培养基，培养过夜）。第二天换液并检查细胞密度。

2）细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。

传代方法：

1.弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。

2.加1-2ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培养瓶中，置于37℃培养箱中消化1-2min，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加5ml以上含10%血清的完全培养基终止消化。

3.轻轻吹打细胞，完全脱落后吸出，在1000RPM条件下离心8-10分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养液后吹匀。

4.按5-6ml/瓶补加培养液，将细胞悬液按1：2到1：5的比例分到新的含5-6 ml培养液的新皿中或者瓶中。

应用^[4][5]

用于长链非编码RNA MALAT 1通过microRNA-19b抑制脂多糖诱导ATDC 5细胞损伤的作用机制研究

探讨长链非编码RNA转移相关肺腺癌转录因子1（lncRNA MALAT 1）对脂多糖（LPS）诱导的小鼠软骨祖细胞（ATDC5）炎症损伤的影响,并探讨其可能机制。

研究方法1、LPS诱导ATDC5细胞凋亡和炎性损伤。在DMEM/F12中培养ADTC5细胞,应用LPS进行处理。采用细胞计数试剂盒-8（CCK-8）法测定不同浓度LPS处理后的ATDC5细胞活性。采用AnnexinV-PE染色法检测不同浓度LPS处理后的ATDC5细胞凋亡。应用Western blotting方法检测不同浓度LPS处理后凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax\Pro-caspase3、Cleaved-caspase3、Pro-caspase9和Cleaved-caspase9的表达。分别用定量逆转录PCR（qRT-PCR）和Western blotting方法检测LPS处理后ATDC5细胞中IL-1β、IL-6、IL-8和TNF-α的mRNA和蛋白表达。应用酶联免疫吸附试验（ELISA）检测LPS处理后ATDC5细胞培养上清中IL-1β、IL-6、IL-8和TNF-α的浓度。

2、LPS处理后ATDC 5细胞中MALAT1的表达。用定量逆转录聚合酶链反应（qRT-PCR）检测LPS处理后ATDC5细胞中MALAT1的表达。

3、MALAT1对LPS诱导的ATDC 5细胞炎性损伤的作用。用pEX-MALAT1和shMALAT1转染LPS处理后的ATDC5细胞。分别用细胞计数试剂盒-8（CCK-8）法和AnnexV-pe染色法检测LPS处理pEX-MALAT1和sh-MALAT1转染后ATDC5细胞活性和凋亡率。用qRT-PCR检测ATDC 5细胞中MALAT1的表达。设立对照组、LPS处理组、LPS+pEX组、LPS+pEX+MALAT1组和LPS+shNC组、LPS+sh+MALAT1组。Western blotting方法分别检测各组Bcl-2、Bax、Pro-caspase 3、.Cleaved-caspase 3、Cleaved-caspase 9、Pro-caspase 9的表达,用qRT-PCR和Western blotting检测各组ATDC5细胞中IL-1β、IL-6、IL-8和TNF-α的mRNA和蛋白表达。ELISA法检测上清液中的IL-1β,IL-6、IL-8和TNF-α的浓度。

4、MALAT1对ATDC5细胞中miR-19b表达的调控。转染pEX-MALAT1或sh-MALAT1后,用qRT-PCR方法检测转染后ATDC5细胞中miR-19b的表达。5、MALAT1通过miR-19b调控LPS诱导ATDC5细胞的炎症损伤。用miR-19b抑制剂转染ATDC5细胞。采用qRT-PCR法检测转染miR-19b抑制剂后ATDC5细胞中miR-19b的表达。

参考文献

[1]A chondrogenic cell line derived from a differentiating culture of AT805 teratocarcinoma cells.Atsumi T,Miwa Y,Kimata K,Ikawa Y.Cell differentiation and development:the official journal of the International Society of Developmental Biologists.1990

[2]T Cell Factor4Is a Pro-catabolic and ApoptoticFactor in Human Articular Chondrocytes by Potentiating Nuclear Factor kB Signaling.Ma B,Zhong L,van Blitterswijk CA,et al.Journal of Biological Chemistry.2013

[3]The long noncoding RNA MALAT1regulates the lipopolysaccharide-induced inflammatory response through its interaction with NF-kB.Zhao G,Su Z,Song D,et al.FEBS Letters.2016

[4]microRNA-9 regulates survival of chondroblasts and cartilage integrity by targeting protogenin.J.Song,D.Kim,C.-H.Chun,E.-J.Jin.Cell Communication and Signaling.2013

[5]潘琳.长链非编码RNA MALAT 1通过microRNA-19b抑制脂多糖诱导ATDC 5细胞损伤的作用机制[D].山东大学,2018.