AEC 显色试剂盒的应用

背景^[1-3]

AEC显色试剂盒适用于辣根过氧化酶(HRP)系统的免疫组化染色，如EliVision、MaxVision和SP法等。

AEC即3-氨基-9-乙基卡唑（3-amino-9-ethylcarbozole），是过氧化物酶（peroxidase）的生色底物，在过氧化氢的存在下失去电子而呈现出颜色变化和积累，形成红色不溶性产物。红色不溶性产物在有机溶剂中会溶解，是HRP结合物常用的底物，在Western Blot、免疫组织化学中应用比较广泛。

AEC显色图

组份：20×醋酸盐浓缩缓冲液（含H2O2,pH5.6）；20×AEC浓缩液。

操作方法

1）在过氧化物酶孵育完成以后，TBS或PBS充分洗涤，一般5min/次，共4次。

2）向1ml蒸馏水中滴加1滴20×AEC浓缩液和1滴20×醋酸盐浓缩缓冲液，混匀，加至标本上。一般避光显色10-30min。若无背景出现则可继续显色。直至显色满意为止。

3）蒸馏水充分洗涤以终止反应。必要时用甲基蓝3-5min或不含酒精的苏木素（Mayer’s）复染。

4）水溶性封片剂封片，显微镜观察。

注意事项：

1.由于AEC生成的颜色产物为脂溶性，因此用于IHC显色后不适合梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片，须用水性封片剂封片。

2.根据情况自行优化实验条件，调整显色时间，获得显色效果。

3.AEC有一定毒性，操作时请采取必要的防护措施。

应用^[4][5]

用于维甲酸对丙烯醛作用下大鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞的影响研究

建立原代大鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞（AECⅡ）的分离、纯化及原代培养的方法,探索丙烯醛对AECⅡ细胞周期的影响,同时观察维生素A酸（RA）能否拮抗丙烯醛对AECⅡ的损伤作用。

方法用4.2u/ml的弹性蛋白酶溶液通过气管插管注入肺泡内,消化分离AECⅡ。把细胞悬液接种到包被有大鼠IgG的塑料平皿中纯化细胞。用倒置显微镜观察细胞生长状况,用电镜、碱性磷酸酶显色法（BCIP/NBT）、改良巴氏染色法、单宁酸染色法、免疫组化染色法鉴定AECⅡ并计算细胞纯度。

用MTT法检测丙烯醛对AECⅡ活力的影响,流式细胞仪检测在丙烯醛及RA作用下AECⅡ细胞周期的变化。

运用反转录定量聚合酶链反应（reverse transcription quantitative polymerase chain reaction,RT-qPCR）技术检测P21、P53在mRNA水平的变化。结果分离所得AECⅡ纯度达到90%以上,倒置显微镜下可见细胞呈岛屿状生长,胞浆内可见大量黑色颗粒。

电镜下可见细胞内有大量板层小体,其中有些板层小体呈空泡状结构,细胞膜上有绒毛装结构。BCIP/NBT染色可见胞浆内有蓝色颗粒。改良巴氏染色法、单宁酸染色法可见胞浆内有黑色颗粒。

抗大鼠肺泡表面活性物质A（SP-A）免疫组化染色呈阳性反应。在丙烯醛作用下,AECⅡ细胞生长明显受到抑制,流式细胞仪检测结果显示,丙烯醛作用下细胞周期被阻滞在G1期,RA对丙烯醛的拮抗作用不明显。RT-qPCR检测结果显示,和对照组相比,丙烯醛作用后P21mRNA表达在其他各组均明显下调,且各干预组之间P21mRNA表达没有明显差异；P53基因表达在对照组和各干预组之间没有明显差异。

参考文献

[1]Lack of mutagenicity of acrolein-induced DNA adducts in mouse and human cells.[J].Kim Sang-in,Pfeifer Gerd P,Besaratinia Ahmad.Cancer research.2007(24)

[2]BIOLOGY OF THE P21-ACTIVATED KINASES[J].Gary M.Bokoch.Annual Review of Biochemistry.2003

[3]Lung epithelial fluid transport and the resolution of pulmonary edema.[J].Matthay Michael A,Folkesson Hans G,Clerici Christine.Physiological reviews.2002(3)

[4]The molecular effects of acrolein.[J].Kehrer J P,Biswal S S.Toxicological sciences:an official journal of the Society of Toxicology.2000(1)

[5]程航远.维甲酸对丙烯醛作用下大鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞的影响[D].兰州大学,2012.