膜蛋白提取试剂盒的应用

背景^[1-3]

膜蛋白提取试剂盒份可提取细胞及组织中的膜蛋白，提取Buffer采用特殊配方在裂解细胞的同时可以选择性地分离提取细胞膜蛋白和细胞器膜蛋白。提取方法简单、可靠、快速同时获得的膜蛋白纯度高，可用于SDS-PAGE、Western Blot、免疫共沉淀或细胞信号传导等后续研究。

膜蛋白结构示意图

操作步骤

1.对于悬浮培养或用细胞刮刮下的贴壁培养细胞，离心收集不少于1X 107细胞，再用预冷的双蒸水稀释至一倍浓度的洗涤液洗涤细胞三次，每次3000 rpm（800 g）离心5 min。

2.对于组织样本（200 mg）尽量去除脂肪组织和结缔组织等非目的组织，冰上剪碎，再用预冷双蒸水稀释至一倍浓度的洗涤液洗涤细胞三次。

3.在上述细胞或组织样本中加入1 mL提取Buffer（使用前，每mL提取Buffer中加入1μl蛋白酶抑制剂和1μl DTT），将组织在4°C环境下置于预冷的玻璃匀浆器中，手动匀浆30~50次，匀质匀浆至没有明显的组织小块。或将细胞超声破碎，每次30 sec，3~4次，每次间隔1 min，置于冰上冷却，超声破碎细胞后应镜检，细胞破碎率不小于90％。因提取Buffer在室温时会分层，请务必在冰上放置30 min后混匀，立即加入。

4.装入1.5 mL的预冷的离心管中，冰上放置10 min左右，期间取出剧烈振荡2~3次，于4°C，14000 rpm（17500 g）离心10 min，弃沉淀，上清转至新管中。

5. 上清置于37°C水浴10 min。再室温，13000 rpm离心5 min，样品分成上层和下层（含膜蛋白）。

6.取下层，加入500μl冰冷灭菌水，4°C放置5 min，再置于37°C水浴10 min。

7.室温，13000 rpm（15000 g）离心5 min，样品分成上层和下层（含膜蛋白）。

8.取下层，加入500μl冰冷灭菌水，4°C放置5 min，再置于37°C水浴10 min。

9.室温，13000 rpm（15000 g）离心5 min，样品分成上层和下层（含膜蛋白）。

10.最终得到的下层即为膜蛋白提取物，冷冻保存。

应用^[4][5]

用于马鹿精子膜蛋白提取方法筛选及电泳体系优化的研究

筛选出马鹿精子膜蛋白提取的适宜方法、建立了其裂解液的理想体系、确定了其SDS-PAGE电泳的条件,同时对其理化性质进行了初步分析。

结果1、马鹿精子膜蛋白提取方法的确定采用三种方法对马鹿精子膜蛋白进行提取,根据SDS-PAGE电泳和BCA蛋白含量检测结果确定了NP-40裂解法为马鹿精子膜蛋白提取的适宜方法。

2、马鹿精子膜蛋白裂解液体系的建立对马鹿精子膜蛋白裂解液中去垢剂NP-40和蛋白酶抑制剂PMSF各设立四个浓度梯度,对裂解液添加体积设立三个梯度,根据SDS-PAGE电泳和BCA蛋白含量检测结果确定了NP-40浓度为0.5%、PMSF浓度为0.5mM、提取时添加裂解液体积为5倍是膜蛋白裂解液的理想体系。

3、马鹿精子膜蛋白SDS-PAGE电泳的条件的确定对马鹿精子膜蛋白SDS-PAGE电泳分离胶设立四个浓度梯度,根据电泳结果确定12%为马鹿精子膜蛋白SDS-PAGE电泳的凝胶条件。

参考文献

[1]A Role for Sperm Surface Protein Disulfide Isomerase Activity in Gamete Fusion:Evidence for the Participation of ERp57[J].Diego A.Ellerman,Diana G.Myles,Paul Primakoff.Developmental Cell.2006(6)

[2]Purification and characterization of the plasma membrane glycosidases of Drosophila melanogaster spermatozoa[J].F.Cattaneo,M.Ogiso,M.Hoshi,M.-E.Perotti,M.E.Pasini.Insect Biochemistry and Molecular Biology.2002(8)

[3]Proteomic Technologies in Modern Biomedical Science[J].V.M.Govorun,A.I.Archakov.Biochemistry（Moscow）.2002(10)

[4]Inhibition of unwanted proteolysis during sample preparation:Evaluation of its efficiency in challenge experiments[J].LilaCastellanos‐Serra,DalilaPaz‐Lago.ELECTROPHORESIS.2002(11)

[5]柯冬蕾.马鹿精子膜蛋白提取方法筛选及电泳体系优化的研究[D].东北林业大学,2008.