SDS细胞裂解液的应用

背景^[1-3]

SDS细胞裂解液是一种比较强烈的细胞组织裂解液，通过阴离子去垢剂SDS促进细胞膜的崩解，特别适用于膜蛋白或者细胞骨架蛋白等难溶蛋白的溶解，有利于膜蛋白，胞浆蛋白、核蛋白、胞浆磷酸化蛋白及细胞核转录因子的提取。

SDS细胞裂解液具有有强烈的蛋白变性作用，不能用于非变性蛋白方面的研究。本产品裂解得到的蛋白样品可用于常规的Western、染色质免疫共沉淀(chromatin immunoprecipitation，ChIP)等。

蛋白检测胶图

使用方法：

1.对于培养细胞样品

(1)融解SDS细胞裂解液，混匀。取适当量的裂解液，在使用前数分钟内加入PMSF，使PMSF的最终浓度为1 mM。

(2)细胞裂解

对于贴壁细胞：去除培养液，用PBS、生理盐水或无血清培养液洗一遍(如果血清中的蛋白没有干扰，可以不洗)。按照6孔板每孔加入150~250μL裂解液的比例加入裂解液。用枪吹打数下，使裂解液和细胞充分接触。通常裂解液接触细胞1~2秒后，细胞就会被裂解。如果用于ChIP，初步裂解后需在冰浴上继续裂解10 min。

对于悬浮细胞：离心收集细胞，用手指把细胞用力弹散。按照6孔板每孔细胞加入150~250μL裂解液的比例加入裂解液。再用手指轻弹以充分裂解细胞。如果细胞量较多，必需分装成50~100万细胞/管，然后再裂解。充分裂解后应没有明显的细胞沉淀。如果用于ChIP，初步裂解后需在冰浴上继续裂解10分钟。

(3)充分裂解后，10000~14000rpm离心3~5 min，取上清，即可进行后续的PAGE、Western和ChIP等操作。

2.对于组织样品：

(1)把组织剪切成细小的碎片。

(2)融解SDS细胞裂解液，混匀。取适当量的裂解液，在使用前数分钟内加入PMSF，使PMSF的最终浓度为1mM。

(3)按照每20毫克组织加入150—250μL裂解液的比例加入裂解液，如果裂解不充分可以适当添加更多的裂解液，如果需要高浓度的蛋白样品，可以适当减少裂解液的用量。具体SDS细胞裂解液的用量参照表1。

(4)用玻璃匀浆器匀浆，直至充分裂解。如果用于ChIP，初步裂解后需在冰浴上继续裂解10分钟。

(5)充分裂解后，10000~14000 rpm离心3~5 min，取上清，即可进行后续的PAGE、Western和ChIP等操作。

应用^[4][5]

用于组蛋白变异体H2A.X在卵母细胞裂解液逆转化小鼠胎儿成纤维细胞（MEFs）成为诱导性多能干细胞（iPSC）中的作用研究

过体外获取小鼠卵母细胞,制备卵母细胞裂解液,利用其中含有的重编程因子,将不同浓度的卵母细胞裂解液（20个/20μl、30个/20μl、40个/20μl、50个/20μl和60个/20μl）与经过适宜浓度链球菌溶血素O（streptolysin O,SLO）（25U）渗透化处理的第三代MEFs共孵育,以研究不同浓度的卵母细胞裂解液对MEFs重编程的影响。然后,通过在卵母细胞裂解液重编程中添加单一的表观遗传修饰因子TSA或5-Aza-dC和同时添加TSA、5-Aza-dC两种因子,观察不同处理之间重编程效率的差异,旨在优化卵母细胞裂解液重编程体细胞的体系,提高重编程效率,减少重编程时间。

结果表明:当卵母细胞裂解液浓度为40个/20μl、50个/20μl和60个/20μl时,iPSCs的集落数（分别为24±1.25个、23.88±0.47个和22±1.63个）极显著高于20个/20μl和30个/20μl处理组的集落数（分别为11.33±1.7个和17±0.82个）（P<0.01）,而卵母细胞裂解液浓度为40个/20μl、50个/20μl以及60个/20μl时所形成的ipscs集落数差异不显著（p>0.05）;当在卵母细胞裂解液重编程基础上同时添加了tsa和5-aza-dc时,ipscs集落数（35.88±0.77个）显著高于只添加一种表观遗传修饰因子tsa或5-aza-dc的集落数（分别为29±1.45个、30±0.98个）（p<0.05）。

因此,在卵母细胞裂解液浓度为40个/20μl、50个/20μl和60个/20μl重编程效率差异不大的情况下,宜采用40个/20μl卵母细胞裂解液重编程mefs,同时,为了提高重编程效率,缩短时间,添加表观遗传修饰因子tsa和5-aza-dc能更大程度的提高卵母细胞裂解液重编程的效率。

参考文献

[1]Histone Variant H2A.X Deposition Pattern Serves as a Functional Epigenetic Mark for Distinguishing the Developmental Potentials of iPSCs[J].Tao Wu,Yifei Liu,Duancheng Wen,Zito Tseng,Martik Tahmasian,Mei Zhong,Shahin Rafii,Matthias Stadtfeld,Konrad Hochedlinger,Andrew Xiao.Cell Stem Cell.2014

[2]Histone Variant H2A.Bbd Is Associated with Active Transcription and mRNA Processing in Human Cells[J].Michael Y.Tolstorukov,Joseph A.Goldman,Cristele Gilbert,Vasily Ogryzko,Robert E.Kingston,Peter J.Park.Molecular Cell.2012(4)

[3]Histone tyrosine phosphorylation comes of age[J].Rakesh Kumar Singh,Akash Gunjan.Epigenetics.2011(2)

[4]Stepwise Histone Replacement by SWR1 Requires Dual Activation with Histone H2A.Z and Canonical Nucleosome[J].Ed Luk,Anand Ranjan,Peter C.FitzGerald,Gaku Mizuguchi,Yingzi Huang,Debbie Wei,Carl Wu.Cell.2010(5)

[5]杨波.组蛋白变异体H2A.X在卵母细胞裂解液逆转化小鼠胎儿成纤维细胞(MEFs)成为诱导性多能干细胞(iPSC)中的作用研究[D].西南大学,2016.