细胞凋亡试剂盒的应用

背景^[1-3]

细胞凋亡试剂盒是用FITC标记的Annexin V作为探针，来检测细胞早期凋亡的发生。

其检测原理为：在正常的活细胞中，磷脂酰丝氨酸（phosphotidylserine，PS）位于细胞膜的内侧，但在早期凋亡的细胞中，PS从细胞膜的内侧翻转到细胞膜的表面，暴露在细胞外环境中。Annexin-Ⅴ（膜联蛋白-V）是一种分子量为35-36 kDa的Ca2+依赖性磷脂结合蛋白，能与PS高亲和力结合，可通过细胞外侧暴露的磷脂酰丝氨酸与凋亡早期细胞的胞膜结合。

凋亡细胞检测图

另外，试剂盒中还提供了碘化丙啶（Propidium Iodide，PI）用来区分存活的早期细胞和坏死或晚期凋亡细胞。PI是一种核酸染料，它不能透过正常细胞或早期凋亡细胞的完整的细胞膜，但可以透过凋亡晚期和坏死细胞的细胞膜而使细胞核染红。因此，将Annexin V与PI联合使用时，PI则被排除在活细胞（Annexin V-/PI-）和早期凋亡细胞（Annexin V+/PI-）之外，而晚期凋亡细胞和坏死细胞同时被FITC和PI结合染色呈现双阳性（Annexin V+/PI+）。

胞凋亡（apoptosis）是研究最多的程序性细胞死亡，是一个主动、高度有序、一系列酶参与的过程。细胞凋亡在保证多细胞生命体健康的过程中扮演着关键角色，对个体正常发育具有重要作用，近年来成为生物学领域中的最热课题之一。

Annexin V是一种分子量为35-36kD的Ca2+依赖性磷脂结合蛋白，能与细胞凋亡过程中翻转到膜外的磷脂酰丝氨酸（PS）高亲和力特异性结合。在正常细胞中，磷脂酰丝氨酸（PS）只分布在细胞膜脂质双层的内侧，而在细胞凋亡早期，细胞膜中的磷脂酰丝氨酸（PS）由脂膜内侧翻向外侧。用标记了荧光素的Annexin V作为荧光探针，利用流式细胞仪或荧光显微镜可检测细胞凋亡的发生。

应用^[4][5]

用于奶牛酮病氧化应激致肝细胞凋亡的信号转导机制研究

体外培养奶牛肝细胞，添加BHBA（0、0.3、1.2、2.4、4.8mM）培养12、24、36h后，应用ELISA和qRT-PCR等分子生物学方法，检测奶牛肝细胞氧化应激状态相关指标GSH-Px、CAT、SOD的活性和mRNA表达水平、H2O2和MDA含量、总抗氧化能力（total antioxidant capacity,TAC）、抑制羟自由基能力。

结果表明，高浓度BHBA能够降低肝细胞抗氧化酶SOD、CAT、GSH-Px的活性和mRNA表达水平，同时降低肝细胞中TAC和抑制羟自由基能力，升高氧化指标H2O2和MDA的水平。

表明高BHBA可引起肝细胞氧化应激。BHBA通过线粒体依赖的ROS-JNK/ERK通路诱导肝细胞凋亡。

在牛肝细胞培养介质中添加BHBA可诱导肝细胞发生氧化应激，ROS含量增加，从而促进c-Jun N端激酶（C-JunNH（2）-terminal kinase,JNK）活化，抑制细胞外信号调节激酶（Extracellular signal-regulatedprotein kinase,ERK）的活化，促进抑癌基因p53的转录和表达，抑制NF E2相关因子2（NF-E2-related factor2,Nrf2）的转录和表达，上调促凋亡基因Bcl2相关蛋白X（Bcl-2-associated X protein,Bax）和Bcl-xL/Bcl-2相关死亡启动子（Bcl-xl/Bcl-2-associated deathpromoter,Bad）的表达，下调抗凋亡基因B细胞淋巴结基因2（B-cell lymphonma gene2,Bcl-2）、Bcl-w和B细胞淋巴结extra large（B-cell lymphoma-extra large,Bcl-xl）的表达，进而引起线粒体膜电位（Mitochondrial membrane potential,MMP）下降，使细胞色素C（Cytochrome c,cytc）和凋亡诱导因子（Apoptosis inducing factor,AIF）释放，激活半胱氨酸蛋白酶3（caspase3）和多腺苷二磷酸多聚酶（PolyADP-ribose polymerase,PARP）。

表明BHBA可以通过线粒体介导的ROS-JNK/ERK信号通路，促进肝细胞凋亡基因表达，抑制抗凋亡基因表达，造成肝细胞凋亡。

参考文献

[1]Risk factors for clinical mastitis,ketosis,and pneumonia in dairy cattle on organic and small conventional farms in the United States[J].R.M.Richert,K.M.Cicconi,M.J.Gamroth,Y.H.Schukken,K.E.Stiglbauer,P.L.Ruegg.Journal of Dairy Science.2013(7)

[2]Epidemiology of subclinical ketosis in early lactation dairy cattle[J].J.A.A.McArt,D.V.Nydam,G.R.Oetzel.Journal of Dairy Science.2012(9)

[3]Alterations of fatty acidβ-oxidation capability in the liver of ketotic cows[J].P.Li,X.B.Li,S.X.Fu,C.C.Wu,X.X.Wang,G.J.Yu,M.Long,Z.Wang,G.W.Liu.Journal of Dairy Science.2012(4)

[4]A field trial on the effect of propylene glycol on milk yield and resolution of ketosis in fresh cows diagnosed with subclinical ketosis[J].J.A.A.McArt,D.V.Nydam,P.A.Ospina,G.R.Oetzel.Journal of Dairy Science.2011(12)

[5]李玉.奶牛酮病氧化应激致肝细胞凋亡的信号转导机制研究[D].吉林大学,2014.