WESTERN抗体洗脱液(强碱性)的应用

背景^[1-3]

WESTERN抗体洗脱液(强碱性)亦称为蛋白印迹膜再生液Stripping buffer或Western一抗二抗去除液，用于Western中转移了蛋白的膜的重复利用，含有氢氧化钠。

在Western中完成了一抗二抗结合和后续的化学发光检测后，有时还需要检测GAPDH、β-actin等表达量相对稳定的管家蛋白或其它蛋白作为参照。Stripping buffer可以洗脱一抗二抗，非常方便地重新利用使用过的膜，检测其它蛋白。Stripping buffer多次重复使用同一张膜，会导致蛋白信号的减弱不宜重复利用膜，一般可以利用2～3次。

Western Blot检测流程

WESTERN抗体洗脱液(强碱性适用于使用ECL类似的化学发光试剂进行的Western检测，用WESTERN抗体洗脱液(强碱性)只需大约15-20分钟即可实现蛋白膜的重复使用，然后可以进行封闭等后续的Western操作。

蛋白质印迹法（免疫印迹试验）即Western Blot。它是分子生物学、生物化学和免疫遗传学中常用的一种实验方法。其基本原理是通过特异性抗体对凝胶电泳处理过的细胞或生物组织样品进行着色。通过分析着色的位置和着色深度获得特定蛋白质在所分析的细胞或组织中表达情况的信息。

应用^[4][5]

用于定量PCR和Western blot结合检测转基因大豆植物组织和商业化大豆相关食品中CP4-EPSPS成分研究

采用CTAB试剂,对Biozol抽提法进行改良提取植物组织中的DNA、RNA和蛋白质；进而结合了定量PCR和Western blot来检测转基因大豆不同组织和不同大豆商业化食品中CP4-EPSPS基因和蛋白的表达。

研究证明改良的Biozol一步法从玉米、大豆、苜蓿和黄瓜组织中不仅能一步提取得到相应的RNA和蛋白质,DNA也有明显的条带。

其中,获得的RNA和DNA样品经紫外分光光度计测定和琼脂糖凝胶电泳分析证明纯度较高,血红素加氧酶（heme oxygenase,HO）基因HO-1和钙依赖蛋白激酶（calcium-dependent protein kinase,CDRK）基因CDRK1的RT-PCR结果呈阳性,所提取的蛋白质也可以用于Western blot分析,且整个提取过程只需3h；与分别提取RNA、DNA和蛋白质的方法相比,本一步法可同时分离单个样品中的三种产品,避免了样品间的误差,而且提取所得的产物纯度较高,为进一步的研究提供了便利。

进而利用基因水平和蛋白水平两种方法检测不同大豆商业化食品中CP4-EPSPS基因和蛋白的表达。所检食物制品包括转基因植物源食品和同时含有大豆蛋白和肉品的食品。

在验证两种方法的可用性之后,研究实验结果表明在部分所检食物中至少有两条蛋白降解条带被检测到（35.5和24.6kD）。在豆腐皮和豆干样品中,检测到了一条蛋白降解条带（24.6kD）,而定量PCR未能在这些样品中检测到CP4-EPSPS基因；相反的,在标注含有大豆蛋白的火腿切片、肉丸和香肠样品中检测到了CP4-EPSPS基因的成分而Western blot却未能检测到蛋白的降解。

参考文献

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[2]Monitoring genetically modified soybean along the industrial soybean oil extraction and refining processes by polymerase chain reaction techniques[J].Joana Costa,Isabel Mafra,Joana S.Amaral,M.B.P.P.Oliveira.Food Research International.2009(1)

[3]Testing for genetically modified organisms（GMOs）:Past,present and future perspectives[J].Arne Holst-Jensen.Biotechnology Advances.2009(6)

[4]Detection of Residues of Genetically Modified Soybeans in Breaded Fried Turkey Cutlets[J].Y.Stram,A.Vilk,I.Klinger.Journal of Food Science.2008(4)

[5]肖笑.定量PCR和Western blot结合检测转基因大豆植物组织和商业化大豆相关食品中CP4-EPSPS成分[D].南京农业大学,2012.