多克隆抗体制备的应用

背景^[1-3]

多克隆抗体制备是由异源抗原（大分子抗原、半抗原偶联物）刺激机体产生免疫反应，有机体浆细胞分泌的一组免疫球蛋白的过程。多克隆抗体由于其可识别多个抗原表位、可引起沉淀反应，制备时间短，成本低的原因广泛应用于研究和诊断方面。

抗原通常是由多个抗原决定簇组成的，由一种抗原决定簇刺激机体，由一个B淋巴细胞接受该抗原刺激所产生的抗体称之为单克隆抗体（MonoclonalAntibody）。

由多种抗原决定簇刺激机体，相应地就产生各种各样的单克隆抗体，这些单克隆抗体混杂在一起就是多克隆抗体，机体内所产生的抗体就是多克隆抗体；除了抗原决定簇的多样性以外，同样一种抗原决定簇，也可刺激机体产生IgG、IgM、IgA、IgE和IgD等五类抗体。

抗原刺激机体，产生免疫学反应，由机体的浆细胞合成并分泌的与抗原有特异性结合能力的一组球蛋白，这就是免疫球蛋白，这种与抗原有特异性结合能力的免疫球蛋白就是抗体。

多克隆抗体制备

多克隆抗体的制备一般包括以下几个步骤：

1、制备抗原。

2、选择实验动物。

3、动物免疫。

4、试取血进行测试，看看是否成功免疫。

5、如果成功免疫，杀死实验动物，采集全部血清。

6、纯化出抗体。

7、鉴定抗体。包括纯度以及特异性。

应用^[4][5]

用于猪ISG43和ISG60蛋白的原核表达及多克隆抗体制备

克隆了ISG60和ISG43基因,将这些基因连接到pMD18-T载体,测序正确后再用Xho I和BamH I双酶切法插入PET-32a（+）克隆位点,成功构建了PET-ISG60和PET-ISG43重组原核表达质粒。将重组质粒转化Rosetta（DE3）衍生菌并用不同浓度的IPTG进行诱导,经SDS-PAGE和Western-Blot分析显示,ISG43在0.5 mM IPTG诱导下表达,ISG60在0.05mMIPTG诱导下表达,ISG43和ISG60两者的重组蛋白都能以包涵体和可溶性蛋白两种形式进行表达。

通过可溶性蛋白形式纯化蛋白获得有活性的免疫原,以纯化的ISG43和ISG60重组活性蛋白作为抗原与弗式佐剂一起免疫小鼠。经过四次免疫后获得了反应性和特异性较高的多克隆抗体。

用Western Blot检测,产生的抗体能与原核表达蛋白发生反应,又能与PK-15细胞中经PolyI:C诱导产生的相应蛋白显示良好反应性。

抗体在稀释比例为1:2000、1:4000、1:8000情况下都能与原核表达蛋白发生特异性反应。同样,抗体在稀释比例为1:600和1:1200时也能与PK-15细胞中表达的相应蛋白发生反应。

参考文献

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[3]Usp18 deficient mammary epithelial cells create an antitumour environment driven by hypersensitivity to IFN‐λand elevated secretion of Cxcl10[J].Christoph Burkart,Kei‐ichiro Arimoto,Tingdong Tang,Xiuli Cong,Nengming Xiao,Yun‐Cai Liu,Sergei V.Kotenko,Lesley G.Ellies,Dong‐Er Zhang.EMBO Mol Med.2013(7)

[4]Ubiquitin specific protease 18（Usp18）is a WT1 transcriptional target[J].Mohammad Shahidul Makki,E.Cristy Ruteshouser,Vicki Huff.Experimental Cell Research.2013(5)

[5]姜炳星.猪ISG43和ISG60蛋白的原核表达及多克隆抗体制备[D].广西大学,2017.