细胞划痕实验的应用

背景^[1-3]

细胞划痕实验是实验室分析细胞迁移能力的常用方法。这种方法的原理是，当细胞长到融合成单层状态时，在融合的单层细胞上人为制造一个空白区域，称为“划痕”。划痕边缘的细胞会逐渐进入空白区域使“划痕”愈合。

细胞划痕实验及结果分析

实验步骤：

1.培养板划线

首先使用marker笔在6孔板背后，用直尺比着，均匀的划横线，大约每隔0.5~1cm一道，横穿过孔。每孔至少穿过5条线。划线时注意线不要太粗。

2.接种细胞

在孔中加入约5×10⁵个细胞（不同的细胞数量有所不同，根据细胞的生长快慢调整），接种原则为过夜后融合率达到100%。

3.细胞划线

24h后用枪头或者无菌牙签，垂直与细胞平面，沿着投一天划在平板背面的线在细胞层上进行划痕(不同孔之间使用同一只枪头或牙签)。

4.清洗细胞

划痕完成后，使用无菌PBS洗细胞3次，洗去不贴壁的细胞，即划线时划线的细胞，是划线后留下的间隙清晰可见，然后更换新鲜无血清培养基。

5.细胞培养、观察

将细胞放入37℃5%CO2培养箱，培养。然后在适当的时间点，如0，6，12，24h取出细胞，显微镜线观察并测量划痕的宽度，并拍照(具体时间依实验需要而定)。

6.结果分析

使用Image J软件打开图片后，随机划取6至8条水平线，计算细胞间距离的均值。

应用^[4][5]

用于硫酸软骨素与地塞米松在自动化软骨细胞划痕损伤修复中的作用研究

1、在自动平台上制造软骨细胞划痕模型。

2、通过划痕闭合情况，获得CS促进软骨损伤修复的浓度。

3、研究硫酸软骨素和地塞米松对软骨细胞损伤修复的影响。

方法：1、体外提取、培养原代SD大鼠关节软骨细胞，通过细胞形态学及II胶原免疫荧光染色方法进行细胞鉴定。

2、应用自动平台制造软骨细胞划痕模型。

3、实时监测观察软骨细胞划痕的闭合过程。

4、应用计数有划痕处固定相等区域内软骨细胞数目，确定促进软骨细胞愈合的硫酸软骨素（CS）浓度。

5、应用live/dead kit staining方法观察细胞存活率。

6、应用免疫荧光技术（Immunofluorescence technique）检测单纯划痕组、CS组、地塞米松组、CS和地塞米松共同作用组对I型及II型胶原的表达情况。

结果：1、应用自动平台制造出8通道的划痕，划痕具有水平的起点、止点及相同的宽度。

2、浓度为200μg/ml的CS对于软骨细胞划痕愈合的促进作用。

3、两种药物共同作用时CS可减轻地塞米松对于软骨细胞增殖的抑制作用，I型胶原表达量较单独应用地塞米松组减少，II型胶原表达量则增多。

结论：1、硫酸软骨素对于软骨细胞划痕愈合具有促进作用，且在浓度200μg/ml时作用效果。

2、硫酸软骨素对于糖皮质激素引起的软骨损伤具有修复作用。如临床应用糖皮质激素，可加用硫酸软骨素保护关节软骨。

参考文献

[1]Topologically defined composites of collagen types I and V as in vitro cell culture scaffolds[J].Katja Franke,Jiranuwat Sapudom,Liv Kalbitzer,Ulf Anderegg,Tilo Pompe.Acta Biomaterialia.2014

[2]Molecular properties and fibril ultrastructure of types II and XI collagens in cartilage of mice expressing exclusively theα1（IIA）collagen isoform[J].Audrey McAlinden,Geoffrey Traeger,Uwe Hansen,Mary Ann Weis,Soumya Ravindran,Louisa Wirthlin,David R.Eyre,Russell J.Fernandes.Matrix Biology.2014

[3]Wound healing gene therapy:cartilage regeneration induced by vascular endothelial growth factor plasmid[J].Katarina Kolostova,Oliver Taltynov,Daniela Pinterova,Michael Boubelik,Otakar Raska,Pavel Hozak,Marie Jirkovska,Vladimir Bobek.American Journal of Otolaryngology--Head and Neck Medicine and Surgery.2012(1)

[4]Culture of bovine articular chondrocytes in funnel-like collagen-PLGA hybrid sponges This work was presented at the International Union of Materials Research Societies（International Conference in Asia）（Qingdao,China,Sep.25–28 2010）.[J].Hongxu Lu,Young-Gwang Ko,Naoki Kawazoe,Guoping Chen.Biomedical Materials.2011(4)

[5]殷贵鲲.硫酸软骨素与地塞米松在自动化软骨细胞划痕损伤修复中的作用[D].大连医科大学,2014.