绿脓菌素测定用对照培养基基础的应用

背景^[1-3]

绿脓菌素测定用对照培养基基础可用于绿脓杆菌的绿脓菌素测定试验。

绿脓菌素（pyocyanin）是由绿脓假单胞菌培养物中产生的绿色色素。

绿脓假单胞菌Pesudomonas pyocyaneum一种细菌。因其寄生在伤口产生色素（绿脓菌素）而使脓汁呈暗绿色。

绿脓杆菌（p.aeruginosa）属假单胞菌属(pseudomonas)，广泛分布于自然界及正常人皮肤、肠道和呼吸道，是临床上较常见的条件致病菌之一。

大小为1.5～3.0×0.5～0.8um，g-杆菌。菌体一端一般有一根鞭毛，运动活泼。

无芽胞，米液型菌株有多糖荚膜或糖萼，具有抗吞噬作用。在普通培养基上生长良好，专性需氧。菌落形态不一，多数直径2～3mm，边缘不剂齐，扁平湿润。在血琼脂平板上形成透明溶血环。液体培养呈混浊生长，并有菌膜形成。

绿脓杆菌能产生两种水溶性色素：一种是绿脓素，为蓝绿色的吩嗪类分合物，无荧光性，具有抗菌作用。另一种为荧光素，呈绿色。绿脓素只有绿脓杆菌产生，故有诊断意义。但广泛使用有效抗生素后筛选出的变异株常丧失其合成能力。

检验原理

蛋白胨和甘油提供碳氮源；氯化镁和硫酸钾促进绿脓色素和荧光素的产生；琼脂是培养基的凝固剂。

用法：

称取本品49.4g,另称取10g甘油,溶解于1000ml蒸馏水中,分装,121℃高压灭菌15分钟,备用。

方法：挑取可疑菌落接种在在绿脓菌素测定用培养基（PDP）斜面上，培养24小时，观察斜面有无色素。如有色素，在试管内加氯仿3.0～5.0mL，充分震摇，使培养物中的绿脓菌素提取在氯仿中，待氯仿提取液呈现绿色时，加1mol/L盐酸约1mL，震摇后静置片刻，上层盐酸溶液中呈现粉红至红色实验结果为阳性，否则为阴性。

绿脓菌素测定用对照培养基

原理：铜绿假单胞菌能产生的绿脓菌素能被氯仿提取，且在水中溶解度比氯仿大，并且会发生可逆的氧化还原反应，氧化时碱性呈蓝色，酸性呈红色。所以加入盐酸溶液并震摇后，绿脓菌素会由氯仿转移至盐酸溶液中，并在酸性环境中呈红色。

应用^[4][5]

用于一株临床菌通过PA2228基因促进铜绿假单胞菌PAO1绿脓菌素产生研究

每一种微生物都能进行种间或种内的信号传递。通过这种信号传递,不同菌株之间会产生一种相互作用,在感染过程中绝大多数相互作用都会对宿主产生不利影响,加大治疗的难度。因此,研究多种致病菌之间的作用机制对于研发新的治疗药物及治疗策略具有重要意义。

实验前期,将铜绿假单胞菌PAO1和实验室保存的100株临床菌分别进行共培养筛选,发现一株临床菌,在共培养情况下能够促进PAO1绿脓菌素的产生,将其命名为E9。为了找出E9作用于PAO1中的基因,构建了转座突变体库,最终筛选出17株目的菌株。共培养时,E9不能促进其绿脓菌素产生,但纯培养时绿脓菌素产量与野生型相似或更高。最后进行测序。

根据筛选的结果,选择表型最为明显的PA2228基因,将其进行缺失突变,得到突变体PAO1（PA2228）。然后,将其与E9进行共培养。结果显示:在E9和PAO1（PA2228）共培养时绿脓菌素产量与PAO1（PA2228）纯培养时一致。

为了排除E9和PAO1（PA2228）共培养时,绿脓菌素不增加是由于PAO1（PA2228）生长劣势的可能性,分别对野生型与突变体的共培养体系中两种菌的比例进行监测。发现两种共培养体系中菌数比例相似。表明在临床菌E9和铜绿假单胞菌共培养时作用于PA2228基因,导致绿脓菌素产量增加。

参考文献

[1]The CydDC ABC transporter of Escherichia coli:new roles for a reductant efflux pump[J].Shepherd Mark.Biochemical Society Transactions.2015(5)

[2]The hierarchy quorum sensing network in Pseudomonas aeruginosa[J].Jasmine Lee,Lianhui Zhang.Protein&Cell.2015(1)

[3]Pyocyanin:production,applications,challenges and new insights[J].Sheeba Jayaseelan,Damotharan Ramaswamy,Selvakumar Dharmaraj.World Journal of Microbiology and Biotechnology.2014(4)

[4]A spider web strategy of type IV pili‐mediated migration to build a fibre‐like Psl polysaccharide matrix in P seudomonas aeruginosa biofilms[J].Shiwei Wang,Matthew R.Parsek,Daniel J.Wozniak,Luyan Z.Ma.Environ Microbiol.2013(8)

[5]胡世坤.一株临床菌通过PA2228基因促进铜绿假单胞菌PAO1绿脓菌素产生[D].西北大学,2019.