BCA蛋白质定量检测试剂盒的应用

背景^[1-3]

BCA蛋白质定量检测试剂盒是进行蛋白质浓度测定的最常用试剂盒。

BCA蛋白定量的主要原理是：蛋白质在碱性条件下，可以将二价Cu2+离子还原成一价Cu+离子。产生的一价Cu+离子可以与BCA（Bicinchoninic acid）试剂结合，最终生成紫色的复合物。该复合物在562 nm处有很强的吸收峰。复合物的多少与蛋白质的浓度呈接近的线性关系。

BCA蛋白质定量检测试剂产品图

BCA蛋白定量试剂盒有许多优点：

1.检测的灵敏度高，检测的蛋白质浓度下限可达20μg/mL。

2.线性范围广，在20-2000μg/mL的范围内，呈接近的线性关系。

3.兼容性良好，产品可以兼容的化学物质非常广泛（详细的兼容情况见附录）。

产品组成​

1.BCA试剂A:500 mL.

2.BCA试剂B:15 mL.

3.蛋白标准品（BSA，2 mg/mL）：10 mL.

使用方法

1.BCA工作液的配制

（1）BCA工作液总体积的计算：

BCA工作液总体积=（标准品数量+待测样品数量+1）×重复数×200μL。

举例：如果标准品数量为8，待测样品数量1，重复数为3，则BCA工作液总体积=（8+1+1）×3×200μL=6000μL

（2）BCA工作液的配制：按50体积的BCA试剂A中加入1体积的BCA试剂B（A:B=50:1），充分混匀。

举例：将5000μL的BCA试剂A与100μL的BCA试剂B混合，得到5100μL的BCA工作液。

2.BSA标准品的配制

将BSA标准品做系列稀释，分别得到如下9个不同浓度的标准品：2000μg/mL，1500μg/mL，1000μg/mL，500μg/mL，250μg/mL，125μg/mL，62.5μg/mL，31.25μg/mL，0μg/mL。

3.取BSA标准品和待测样品各25μL到96孔板孔内，

4.往每孔中加入200μL的BCA工作液，盖上96孔板盖子。

5.将96孔板放37℃，30分钟。

6.用酶标仪测562 nm处的光吸收值。

7.根据BSA标准品的光吸收值（扣除空白孔的光吸收值即为最终的读数），绘制标准曲线。依据标准曲线计算待测样品的蛋白浓度。

应用^[4][5]

用于不同倍性水稻不同发育时期胚乳蛋白含量测定与谷蛋白质谱分析研究

以矮脚南特同源四倍体为材料、相应的二倍体为对照,利用BCA蛋白质浓度测定法,对稻米胚乳不同发育时期的4种蛋白（清蛋白、球蛋白、醇溶蛋白和谷蛋白）的积累动态进行了深入研究,并对谷蛋白进行了质谱分析,比较分析同一时期不同材料的谷蛋白及不同时期同一材料的谷蛋白的表达差异。

结果：同源四倍体水稻的贮藏蛋白各组分分布与其二倍体水稻基本一致。同源四倍体水稻与其二倍体水稻相比,其四种主要贮藏蛋白组分的含量有上调,也有下调。

开花授粉后第6d,清球蛋白含量同源四倍体水稻高于二倍体水稻,授粉后第7d后清球蛋白含量二倍体高于四倍体,一直到授粉后第20d接近持平;醇溶蛋白含量授粉后第6d到第9d之间基本持平,授粉后第9d二倍体含量高于四倍体;谷蛋白含量从授粉后第6d到第9d处于上升阶段,授粉后第9d后含量有所下降,授粉后第12d谷蛋白又有所增加,授粉后第15d含量又下降,授粉后第20d谷蛋白含量明显比授粉后第15d有所减少。

二倍体与四倍体水稻谷蛋白含量变化趋势相一致,含量对比,前期二倍体水稻谷蛋白含量比四倍体含量多,后期四倍体水稻谷蛋白含量多。

矮脚南特同源四倍体水稻与二倍体水稻清球蛋白含量从授粉后第6d开始积累且一直呈现上升趋势,醇溶蛋白含量从授粉后第9d开始积累。谷蛋白含量从授粉后第9d开始下降,接着授粉后第12d又继续积累,15d含量到达顶峰,接着又下降一直到授粉后第20d,因此授粉后第9d,12d,15d和20d是谷蛋白含量积累的重要时间点。

参考文献

[1]Polyploidy and genome evolution in plants[J].Keith L Adams,Jonathan F Wendel.Current Opinion in Plant Biology.2005(2)

[2]Genome evolution in polyploids[J].Jonathan F.Wendel.Plant Molecular Biology.2000(1)

[3]Identification of cis-regulatory elements required for endosperm expression of the rice storage protein glutelin gene GluB-1[J].Haruhiko Washida,Chuan-Yin Wu,Akihiro Suzuki,Utako Yamanouchi,Tomoya Akihama,Kyuya Harada,Fumio Takaiwa.Plant Molecular Biology.1999(1)

[4]Deposition of storage proteins[J].Klaus Müntz.Plant Molecular Biology.1998(1)

[5]冼霖.不同倍性水稻不同发育时期胚乳蛋白含量测定与谷蛋白质谱分析[D].华南农业大学,2018.