HSF人皮肤成纤维细胞的应用

背景^[1-3]

HSF人皮肤成纤维细胞来源于人皮肤组织的贴壁细胞，贴壁生长形态为长梭形或多角形，支原体、细菌、酵母和真菌检测为阴性。培养条件需添加含胎牛的血清。

成纤维细胞胞体呈梭型或不规则三角形，中央有卵圆形核，胞质突起，生长时呈放射状。除真正的成纤维细胞外，凡由中胚层间充质起源的组织，如心肌、平滑肌、成骨细胞、血管内皮等常呈本型状态。

另外，凡培养中细胞的形态与成纤维类似时皆可称之为成纤维细胞。体外培养的成纤维细胞多为梭形、多角形和扁平星形等，其形态尚可依细胞的功能变化及其附着处的物理性状不同而发生改变。

电镜下，其胞质可见丰富的粗面内质网、游离核糖体和发达的高尔基复合体。处于成熟期或称静止状态的成纤维细胞，胞体变小，呈长梭形，粗面内质网和高尔基复合体均不发达。它具有较强的分裂增殖能力，适应性强，是最容易培养的动物细胞类型之一。

贴壁细胞传代方法：

1.弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。

2.加2ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培养瓶中，置于37℃培养箱中消化1-2分钟，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加入3ml此细胞的培养基终止消化。

3.轻轻吹打后吸出，移入15ml离心管中，在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，加入1mL培养液后吹匀。

4.移入到事先准备好的含有5ml培养基的培养瓶中或含有14ml培养基的培养瓶中培养。

应用^[4][5]

用于绞股蓝总皂苷对人皮肤成纤维细胞光老化模型凋亡信号通路的影响研究

通过采用长波紫外线（UVA）辐射人体皮肤成纤维细胞（HSF），诱导细胞发生光老化现象后，采用不同浓度绞股蓝总皂苷（Gyp）含药血清进行干预，观察各组皮肤细胞在增殖活性、ROS含量、细胞凋亡数量以及凋亡相关调控因子Bcl-2，Bax，Caspase-3mRNA和蛋白表达变化，探究Gyp干预光老化细胞凋亡作用相关分子机制，探索Gyp对HSF细胞光老化损伤有明确防治作用新靶点，为绞股蓝作为靶点药物用于防治人体皮肤光老化及相关疾病提供理论基础及实验数据。

实验材料：健康SPF级Sprague-Dawley（SD）雄性大鼠20只，体重200～250g。皮肤成纤维细胞株（HSF）；绞股蓝总皂苷（MUST-11031401）；DMEM高糖培养液；胎牛血清（FBS）；胰蛋白酶；PBS缓冲液；二甲基亚砜（DMSO）；UVA光源（20W），紫外光光度计；MTT；细胞凋亡原位检测试剂盒；水合氯醛；青/链霉素；无水乙醇；75%乙醇；兔抗人Bax、Bcl-2及内参β-actin抗体；HRP标记的羊抗兔二抗；ECL发光试剂盒；Trizol；Bax、Bcl-2及内参引物；PCR仪、电泳仪，凝胶成像分析系统；细胞蛋白提取试剂；BCA法蛋白定量试剂盒；ECL发光液；电热恒温振荡器；酶标仪；凝胶成像分析系统；水平摇床；垂直板电泳装置；电泳仪；转印电泳槽等。

Gyp对光老化皮肤成纤维细胞增殖的影响

1. 绞股蓝总皂苷（Gyp）含药血清制备将20只SD大鼠按随机数字法分为空白血清对照组和Gyp含药血清组。含药血清组给予Gyp粉末生理盐水溶液（生药质量浓度为80mg Kg-1d-1）灌胃，空白血清对照组给予等体积的生理盐水，连续灌胃7d。然后于腹主动脉采血，血液经离心后分离出血清，冻存备用。

2. 人皮肤成纤维细胞（HSF）培养及光老化模型复制将HSF细胞株消化传代。待倒置显微镜下观察到细胞长满瓶底时，放入冰箱中保存。造模时，取出冻存的HSF细胞，解冻后将细胞悬液移入培养瓶，加入新鲜培养液培养。

参考文献

[1]Worldwide Increasing Incidences of Cutaneous Malignant Melanoma[J].Dianne E.Godar,Arash Kimyai-Asadi.Journal of Skin Cancer.2011

[2]A review of human carcinogens—Part D:radiation[J].Fatiha El Ghissassi,Robert Baan,Kurt Straif,Yann Grosse,Béatrice Secretan,Véronique Bouvard,Lamia Benbrahim-Tallaa,Neela Guha,Crystal Freeman,Laurent Galichet,Vincent Cogliano.Lancet Oncology.2009(8)

[3]Protective effect of green tea extract on gentamicin-induced nephrotoxicity and oxidative damage in rat kidney[J].Sara A.Khan,Shubha Priyamvada,Neelam Farooq,Sheeba Khan,Md Wasim Khan,Ahad N.K.Yusufi.Pharmacological Research.2009(4)

[4]Mitochondrial alterations in aging rat brain:effective role of（?）-epigallo catechin gallate[J].Ravichandran Srividhya,Kamelija Zarkovic,Marina Stroser,Georg Waeg,Neven Zarkovic,Periandavan Kalaiselvi.International Journal of Developmental Neuroscience.2009(3)

[5]王刘祥.UVA辐射对人皮肤成纤维细胞的过氧化损伤及EGCG的保护作用[D].浙江大学,2013.