SH-SY5Y细胞的应用

背景^[1-3]

SH-SY5Y细胞来源于1970年建立的一神经母细胞瘤患者的转移骨瘤灶细胞SK-N-SH经三次克隆后的亚系(SK-N-SH→SH-SY→SH-SY5→SH-SY5Y)。该细胞显示中等水平的多巴胺-β-羟基酶活性。SH-SY5Y细胞的生长密度可高达1X106细胞/cm2，生长成悬浮和贴壁混合生长，有的聚集成细胞丛。

显微镜下，神经母细胞瘤呈现为蓝染的小圆形细胞，菊花形排列。肿瘤细胞围绕神经毡（neuropil）呈菊花形排列，与其他的肿瘤（如视神经母细胞瘤）围绕血管呈菊花形排列有所不同。其他还有一些神经母细胞瘤所特异的免疫组化染色，用以与其他肿瘤（尤因肉瘤，淋巴瘤等）进行鉴别诊断。

细胞培养方法：

1、细胞传代：细胞密度达到80-90%时即可传代

①弃去培养上清，用PBS或生理盐水清洗1-2次；

②加入2ml0.25%胰酶（T25瓶），使胰酶覆盖整个瓶或皿，盖好放入培养箱消化；

③1-2min后，显微镜下观察细胞，若大部分细胞回缩且有少量细胞脱落，轻轻吹打下确认消化情况后加入完全培养基终止消化；若细胞还是贴壁，放回培养箱继续消化至可以轻轻吹打下为止；

④将细胞悬液1000RPM左右条件下离心4min，弃上清；

⑤用新鲜培养基重悬后加入培养瓶或皿中，T25培养瓶加6-8ml培养基；

⑥悬浮细胞直接离心收集，细胞沉淀重悬后分到新培养瓶中。

2、细胞复苏：

①将冻存管在37℃温水中快速摇晃融化，时间1min左右，加入4-5ml培养基混匀。

②在1000RPM左右条件下离心4min，弃上清,加1-2ml培养基吹匀，将细胞悬液加入培养瓶中，补加适量培养基。

应用^[4][5]

用于PARP-1依赖性程序性细胞死亡（Parthanatos）在布比卡因致SH-SY5Y细胞损伤中作用的研究

应用SH-SY5Y细胞培养技术,通过检测细胞内PARP-1的表达、PAR含量变化及细胞内NAD+水平的变化,初步明确布比卡因所致的神经毒性中是否存在Parthanatos;同时通过外源性NAD对布比卡因所致的细胞内ROS含量增加、线粒体膜电位降低、细胞核损伤及细胞凋亡的影响,确定外源性NAD是否有助于减轻布比卡因的神经毒性。

其目的在于从新的角度探讨在布比卡因神经毒性的机制,为临床上防治局麻药的神经毒性提供实验依据。第1章布比卡因神经毒性是否与多聚腺嘌呤二核苷酸核糖聚合酶-1（Poly（ADP-ribose）polymerase-1,PARP-1）激活有关目的明确布比卡因是否导致SH-SY5Y细胞PARP-1激活,其神经毒性是否与激活PARP-1有关。

方法以1-10mM布比卡因培养液处理SH-SY5Y细胞30分钟-6小时,以Western-blot法检测细胞内PARP-1及其代谢产物-多聚腺苷二磷酸核糖（Poly-（ADP）ribose,PAR）的表达情况；以100nM、200nM的PARP-1抑制剂-PJ34培养液与5mM布比卡因培养液共同处理细胞30分钟,或单独以5mM布比卡因处理细胞30分钟,光镜下观察其对布比卡因所致细胞形态改变的影响,并以CCK-8法其对细胞存活率的影响。

计量资料以均数±标准差（x±s）表示,采用SPSS17.0统计软件分析。不同浓度布比卡因处理30分钟后细胞内PARP-1及PAR的表达、1mM布比卡因处理0-6小时后细胞内PAPR-1及PAR的表达采用完全随机单因素方差分析,组间比较采用LSD法（方差齐）或Dunnett’s T3法（方差不齐）；PJ34对布比卡因处理后细胞存活率的影响采用两因素析因设计资料方差分析,组间比较采用LSD法（方差齐）或Dunnett’s T3法（方差不齐）。

参考文献

[1]Glutathione synthesis and its role in redox signaling[J].Hongqiao Zhang,Henry Jay Forman.Seminars in Cell and Developmental Biology.2012(7)

[2]Bupivacaine induces apoptosis via mitochondria and p38 MAPK dependent pathways[J].Jun Lu,Shi yuan Xu,Qing guo Zhang,Rui Xu,Hong yi Lei.European Journal of Pharmacology.2011(1)

[3]Ropivacaine Versus Bupivacaine for Epidural Labor Analgesia[J].Yaakov Beilin,Stephen Halpern.Anesthesia&Analgesia.2010(2)

[4]PARP inhibitors:New tools to protect from inflammation[J].Vincenzo Giansanti,Francesca Donà,Micol Tillhon,A.Ivana Scovassi.Biochemical Pharmacology.2010(12)

[5]郑艇.PARP-1依赖性程序性细胞死亡（Parthanatos）在布比卡因致SH-SY5Y细胞损伤中作用的研究[D].南方医科大学,2014.