细菌总蛋白提取试剂盒的应用

背景^[1-3]

细菌总蛋白提取试剂盒用于大肠杆菌提取可溶性蛋白，试剂盒中的裂解液含有蛋白酶抑制剂，作用较为强烈，可快速获得总蛋白，可用于免疫印迹实验等基础研究实验，由于含有上述的酶抑制剂，不能用于研究蛋白激酶的研究。细菌蛋白提取试剂盒仅用于科研。

操作方法:

1、细菌可溶性蛋白的提取

在1ml的冷裂解液中各加入10ul的蛋白酶抑制剂和PMSF；混匀，放置在冰上备用；将菌体湿重称重，然后按照比例（1g：10ml）加入的新配置的裂解液，混匀，过程注意冰上操作；将混匀液移入超声仪中，超声；

超声条件：总时间45min，超声时间3s，间隔时间3s，过程为冰浴环境；

超声结束，4度离心，10000r/min20min；吸取上清至新的管中；

进行蛋白定量或者变性进行蛋白实验。（提取好的蛋白建议保存于-80 oC，即用即取，避免反复冻融，避免长时间储存。)

细菌总蛋白提取试剂盒特点：

1.可以处理各种细菌菌体，包括新鲜菌液或冰冻菌体沉淀。

2.在1.5 mL塑料离心管中操作，适用于大规模的快速筛选。

3.采用温和的中性裂解成分，蛋白保持天然活性。

4.无须昂贵设备，无需溶菌酶、超声波破碎等复杂的操作步骤，离心分离即可得到，简单便捷。

5.得到的提取物可以直接用于SDS-PAGE、2D电泳、免疫印迹分析、蛋白活性测定和BCA法和及Lowry法蛋白定量（不适用于Bradford法）。

应用^[4][5]

用于光合细菌生物转化槲寄生转化机理及其抗肿瘤作用物质基础初步研究

研究光合细菌生物转化槲寄生的转化机理,并且对光合细菌生物转化槲寄生培养液中具有细胞毒活性的蛋白质和总三萜类物质进行研究。

方法：（1）采用pH计测定光合细菌转化槲寄生过程中培养液pH的变化趋势；

（2）聚丙烯酰胺凝胶电泳法获得光合细菌（PSB）蛋白质、酯酶、过氧化物酶及超氧化物歧化酶的电泳图谱；

（3）槲寄生提取液中添加吲哚,以PSB进行生物转化,通过HPLC法测定靛蓝的生成量来反映PSB加氧酶活性。

将光合细菌转化槲寄生培养液（PSBT）离心,得到PSBT上清液和菌体沉淀。菌体沉淀用超声波辅助冻融法破碎,离心,上清液即为PSBT菌体沉淀提取液。取PSBT上清液及PSBT菌体沉淀提取液,进行硫酸铵沉淀和透析,分别得PSBT上清液总蛋白提取液和菌体沉淀总蛋白提取液。取不同浓度的总蛋白质提取液,用MTT法测定细胞毒活性。

利用AKTA purifier 10层析系统,Hitrap Desalting和CM Fast Flow等层析柱,采用不同缓冲液体系对PSBT上清液总蛋白提取液进行蛋白质纯化。实验三：采用紫外分光光度法对槲寄生提取物和PSBT中三萜类化合物进行比较研究；分别采用薄层色谱法和高效液相色谱法（HPLC）对齐墩果酸进行定性分析和含量测定,HPLC色谱条件：色谱柱为Diamonsil C18（200mm×4.6mm,i.d.5μm）,流动相为甲醇-0.18%的磷酸水（86：14）,检测波长210nm,柱温25℃,流速1ml/min。

结果：（1）接种PSB后,纯PSB培养液pH缓慢上升,PSBT的pH迅速下降；

（2）PSBT中菌体蛋白质、酯酶、过氧化物酶及超氧化物歧化酶的电泳图谱与纯PSB培养液中菌体的电泳图谱不同；

（3）未得到PSBT和纯PSB培养液中菌体的超氧化物歧化酶（SOD）电泳图谱

（4）加入吲哚后,PSBT中有靛蓝类物质生成,而纯PSB培养液中无靛蓝产生。

参考文献

[1]Potential applications of peroxidases[J].Mohsina Hamid,Khalil-ur-Rehman.Food Chemistry.2009(4)

[2]Optimization of bio-indigo production by recombinant E.coli harboring fmo gene[J].Gui Hwan Han,Hyun-Jae Shin,Si Wouk Kim.Enzyme and Microbial Technology.2008(7)

[3]Silver staining of an esterase compatible with activity and mass spectrometry analysis after separation using non-denaturing two-dimensional electrophoresis[J].Youji Shimazaki,Sono Watanabe.Clinica Chimica Acta.2008(1)

[4]On Genetic Algorithms and their Applications[J].Yasmin H.Said.Handbook of Statistics.2005

[5]牛红军.光合细菌生物转化槲寄生转化机理及其抗肿瘤作用物质基础初步研究[D].山西医科大学,2010.