牛血清白蛋白的特点与应用

牛血清白蛋白BSA（Bovine Serum Albumin，BSA）大概是生化实验室最为常见、应用最为广泛的蛋白质了。虽然小小的BSA并不那么起眼，但是在生化实验当中，却常常扮演十分关键的角色。

BSA的结构特点

BSA前体蛋白全长607个氨基酸。前体蛋白从N端脱去18个信号肽，以及6个前肽，形成含有583个氨基酸、分子量约为66.5kDa的成熟BSA蛋白。

由于BSA酸性氨基酸数量要多于碱性氨基酸，其等电点约为4.7。BSA在溶液中的表面电荷（Zeta potential）受到溶液pH的影响。当pH大于等电点时BSA带负电，小于等电点时BSA带正电。

△BSA表面电荷于pH之间的关系（BSA浓度为15mg/mL）

另外pH还会影响到BSA在水溶液中的分子尺寸。当BSA溶液pH从7.0下降到4.7，等电点附近时，BSA分子尺寸没有明显的变化，但是，当pH从4.7下降至3.0时，BSA在水溶液中的粒径从10nm左右，增加到12.5nm左右。一个可能的原因是，BSA的碱性氨基酸大多数分布在分子内测，当溶液pH小于BSA等电点，碱性氨基酸开始电离，暴露在BSA蛋白质表面。另外，出于同样原因，当溶液pH降低，BSA的内部疏水基团也会随之暴露在蛋白表面，而使BSA变得更为疏水。

应用

BSA的应用非常广泛。在生化实验中，常将BSA用于维持蛋白稳定性，以及ELISA实验、western blot，以及磁免疫检测中的固相封闭。

维持蛋白的稳定性

当蛋白质处于“压力”的状态下，如加热、紫外照射、氧化、剪切力等，蛋白质的空间折叠趋于延展，导致内部疏水位点暴露，发生无定形聚集或者形成高结构化的淀粉样蛋白，从而失去生物活性。BSA具有良好的热稳定性，当温度上升至65度时，其空间结构的变化依然是可逆的。BSA另一个特点是能够和许多物质形成可逆结合，特别是水溶性较差的物质，如脂肪酸、血红素、胆红素、带负电荷的芳香化合物等，能够增加其水溶性。因此，BSA是理想的蛋白保护剂。当酶、或抗体等蛋白质发生空间结构变化，BSA能够与其发生可逆结合，形成稳定的、可溶的高分子复合物，防止蛋白发生无定形聚集。另外，溶液中的BSA能够与容器表面结合，防止蛋白吸附在容器表面而浓度降低。

如1995年Chang等人发现，蛋白质的稳定性是由蛋白表面的疏水性决定的。当温度升高时，酶的疏水位点暴露，溶液中的BSA与酶的疏水区域结合，从而维持酶的水溶性，防止发生聚集，有效提高酶的热稳定性。并且，疏水性越强的保护蛋白，对酶的保护作用越强。

免疫检测当中固相封闭蛋白

在免疫检测过程中，需要将抗体固定在固相表面，如微孔板，磁颗粒、聚苯乙烯微球或硝酸纤维膜表面。由于蛋白是一种粘性较大的分子，检测过程中，样本中的杂蛋白会与固相表面的疏水位点发生非特异性结合，造成背景干扰。因此，需要将固相表面的多余位点用封闭剂将其封闭，常用的封闭剂，如BSA、酪蛋白、明胶等能够吸附在固相表面，防止抗体、或者抗原与固相表面发生非特异性结合，降低检测本底，提高灵敏度。

BSA是一种球蛋白，分子量约为66.5kDa，表面含有大量的氨基和羧基残基，并且BSA的空间结构能够随着温度、pH、盐浓度发生变化，是一种柔性分子。作为常见的封闭蛋白，BSA能够与亲水表面、疏水表面，以及活化的共价结合表面，如活化羧基、氨基、环氧基、甲苯磺酰基等结合，抑制非特异性吸附，是一种理想的固相封闭剂。

BSA表面含有大量的羧基、氨基，能够用于表面的活化基团结合，封闭多余位点，最为常见的是化学发光免疫磁珠偶联抗体当中的应用。如用EDC活化羧基表面磁珠后，能够和抗体表面氨基反应，使抗体共价结合在磁珠表面。这一过程需要对多余的活化羧基位点进行封闭，BSA分子尺寸更小，能够进入到表面抗体间的间隙，并且由于表面含有大量的氨基，与活化羧基反应，封闭多余的活性位点。同时，BSA表面含有大量的羧基，还能够改善磁珠的亲水性。另外，BSA表面含有一定的氨基酸疏水残基，如丙氨酸、亮氨酸等，也能够对表面的疏水位点进行封闭。

值得注意的是，Larsericsdotter等人研究发现，BSA在磷酸盐溶液中，在固相表面吸附更为紧凑，形成的结构也更为稳定。这是因为，磷酸盐与BSA上的甘氨酸和精氨酸结合，能够消除结构性静电排斥。因此BSA在磷酸缓冲液中结构更为稳定，在固相表面具有更高的结合效率。

BSA的隐患

采用BSA作为稳定剂和封闭剂一个的问题是批次之间的差异。作为生物来源的蛋白质，不同厂家的BSA规格不一致，同一厂家，不同批次之间的差异，都会给实验结果带来巨大的差异。为了保证实验的一致性，国内大多数厂家都选用进口的BSA，如Biowest，Sigma，Thermofisher，Merck，Bovogen，Proliant等。

同时不少厂家都推出了无蛋白稳定剂，以及化学合成的封闭剂，作为BSA替代。如Synblock系列，以及JSR推出的Blockmaster系列等。其中JSR公司利用独有技术，开发了一系列的聚合物型封闭剂，适用于磁珠封闭。CE510/CE210采用生物相容性极高的柔性分子聚乙二醇（PEG）作为骨架，在PEG一端修饰一段寡氨，能够和磁珠表面活化的羧基、或者疏水位点发生反应，固定在磁珠表面，从而起到封闭的作用。同时，由于PEG是极强的亲水性柔性大分子，能够增加磁珠表面的水化层，有效降低磁珠的沉降速率，并且对表面修饰的抗体起到支撑作用。

BSA除了能够用作蛋白稳定剂、固相封闭剂之外，还可以作为小分子的载体，如通过把荧光分子修饰在BSA表面，再将荧光-BSA与抗体偶联，在增加荧光强度的同时，避免由于抗体的过度修饰而导致抗体失活。

BSA是生化实验室最常用的蛋白之一，而实验中，可能因为它过于常见、过于平凡而忽略了它的重要性。本文对BSA的分子结构，氨基酸数目，以及BSA维持热稳定性功能，免疫检测封闭功能进行了基本的描述。如何选择合适的BSA，如何设定BSA的质控，以及如何程度的发挥BSA的性能，对于一个实验室来说也是一个大的课题。