RS1细胞的应用

背景^[1-3]

RS1细胞是大鼠皮肤成纤维样细胞来源于一大鼠的皮肤组织。成纤维细胞胞体呈梭型或不规则三角形，中央有卵圆形核，胞质突起，生长时呈放射状。除真正的成纤维细胞外，凡由中胚层间充质起源的组织，如心肌、平滑肌、成骨细胞、血管内皮等常呈本型状态。另外，凡培养中细胞的形态与成纤维类似时皆可称之为成纤维细胞。

体外培养的成纤维细胞多为梭形、多角形和扁平星形等，其形态尚可依细胞的功能变化及其附着处的物理性状不同而发生改变。电镜下，其胞质可见丰富的粗面内质网、游离核糖体和发达的高尔基复合体。处于成熟期或称静止状态的成纤维细胞，胞体变小，呈长梭形，粗面内质网和高尔基复合体均不发达。它具有较强的分裂增殖能力，适应性强，是最容易培养的动物细胞类型之一。

成纤维细胞是疏松结缔组织的主要细胞成分，细胞呈梭形或扁的星状，具有突起。根据不同的功能活动状态，将细胞分为成纤维细胞和纤维细胞二型。

成纤维细胞是功能活动旺盛的细胞，细胞和细胞核较大，轮廓清楚，核仁大而明显，细胞质弱嗜碱性，具明显的蛋白质合成和分泌活动；处于成熟期或称静止状态的成纤维细胞，胞体变小，呈长梭形，粗面内质网和高尔基复合体均不发达，被称为纤维细胞。

纤维细胞功能活动不活跃，细胞轮廓不明显，核小着色深，核仁不明显，细胞质少。在外伤等因素刺激下，部分纤维细胞可重新转变为幼稚的成纤维细胞，其功能活动也得以恢复，参与组织损伤后的修复。

应用^[4][5]

用于PAI-1-RNAi对SD大鼠皮肤成纤维细胞增殖的影响研究

应用RNA干扰（RNA Interference,RNAi）技术下调纤溶酶原激活抑制剂-1（Plasminogen Activator Inhibitor-1,PAI-1）表达对SD大鼠皮肤成纤维细胞（fibroblast）增殖的影响,通过体外实验从细胞水平探究PAI-1对成纤维细胞增殖、转化的作用,进一步为前期动物实验PAI-1 siRNA可改善SD大鼠瘢痕疙瘩模型提供理论依据,为瘢痕疙瘩（keloid）基因治疗开辟新思路。

方法:1 SD大鼠皮肤成纤维细胞培养采用组织块培养法获取原代SD大鼠皮肤成纤维细胞,经传代培养去除上皮细胞、红细胞等杂质成分,获取单一成纤维细胞,倒置显微镜下观察细胞生长及形态变化。

2免疫细胞化学法鉴定细胞应用免疫细胞化学法,通过检测波形蛋白表达是否阳性,鉴定所培养的细胞是否为成纤维细胞。

3 PAI-1 siRNA转染至体外培养的成纤维细胞,并进行实验分组利用脂质体（Lipofectamine 2000）转染siRNA至体外培养传代至第六代的成纤维细胞,根据转染不同设置实验分组为:转染PAI-1 siRNA的实验组、转染NC siRNA的阴性对照组、不进行转染的空白对照组。

4应用RT-PCR法检测转染24小时,PAI-1 m RNA、TGF-β1 m RNA的表达。

5应用Western blot法测定转染48小时,PAI-1、AKT、ERK、p-AKT、p-ERK蛋白的表达。

6应用台盼蓝染色法计数细胞并绘制曲线。分别于转染24小时、48小时、72小时,制备细胞悬液进行台盼蓝染色,镜下计数细胞总数以及未被染液染色的细胞总数（或被染色的细胞总数）,以培养时间为横坐标,细胞计数为纵坐标,绘制成纤维细胞生长曲线及成纤维细胞成活率曲线。

7应用CCK-8测定成纤维细胞的增殖活力绘制曲线。分别于转染24小时、48小时、72小时加入CCK-8试剂,孵育4小时后,通过使用酶联免疫检测仪测定吸光度（OD值）,根据计算公式,得出细胞的OD值、细胞增殖抑制百分率（%）。以培养时间为横坐标,细胞的OD值为纵坐标绘制生长曲线;以培养时间为横坐标,细胞增殖抑制百分率（%）为纵坐标绘制增殖抑制率曲线。

8统计学处理本实验所有数据应用SPSS 21.0统计软件,实验数据为计量资料,采用均数±标准差表示,统计结果以P<0.05认为差异有统计学意义。

参考文献

[1]Clinical Implications of Single-Versus Multiple-Site Keloid Disorder:A Retrospective Study in an Asian Population[J].Tae Hwan Park,Ji Hae Park,Michael H.Tirgan,Ahmad Sukari Halim,Choong Hyun Chang.Annals of Plastic Surgery.2015(2)

[2]Nd:YAG Laser Treatment for Keloids and Hypertrophic Scars:An Analysis of 102 Cases[J].Sachiko Koike,Satoshi Akaishi,Yuki Nagashima,Teruyuki Dohi,Hiko Hyakusoku,Rei Ogawa.Plastic and Reconstructive Surgery Global Open.2014(12)

[3]Keloid incidence in Asian people and its comorbidity with other fibrosis-related diseases:a nationwide population-based study[J].Lei-Ming Sun,Kuo-Hsien Wang,Yuan-Chii G.Lee.Archives of Dermatological Research.2014(9)

[4]Aesthetic earlobe remodeling:my personal experience with an LBO laser at 532 nm[J].Luca Scrimali,Serena Tamburino.Journal of Cosmetic and Laser Therapy.2014(3)

[5]刘乐.PAI-1-RNAi对SD大鼠皮肤成纤维细胞增殖的影响[D].河北医科大学,2017.