MDCK狗肾细胞的应用

背景^[1-3]

MDCK狗肾细胞是由S·H·Madin和N·B·Darby在1958年9月从一只外观正常的成年雌性英国小猎犬的肾分离得到的；MDCK(NBL-2)细胞角蛋白免疫过氧化物酶染色呈阳性；MDCK(NBL-2)细胞被用于研究β-粥样蛋白前体的处理及其蛋白水解产物。

MDCK(NBL-2)（犬肾细胞）操作说明：

1)对于常温运输的细胞，收到细胞后，检查是否有运输问题，即细胞培养瓶或管是否破损，细胞培养液是否溢出。若没有运输问题，请75%酒精消毒后，保留封口膜，放入细胞培养箱中静置。严格检查培养箱的参数：温度，湿度和CO2浓度。细胞静置时间一般为6-12小时后，细胞状态稳定后，即可开始后续操作。选用正确的细胞培养体系。

2)对于干冰运输的细胞，请取出冷冻管后，须立即放入37C水槽中快速解冻，轻摇冷冻管使其在1分钟内全部融化，并注意水面不可超过冷冻管盖沿，否则易发生污染情形。然后将其复苏培养，次日更换培养液。

应用^[4][5]

用于犬细小病毒YBYJ株全基因组克隆及其诱导MDCK细胞凋亡的初步研究

首先根据GeneBank中已发表的CPV序列设计7对引物,对CPV YBYJ株全基因组分段扩增,克隆和测序,用DNAstar对测序结果拼接,其全基因组包含5 051个核苷酸。

与GeneBank中发表的其它犬细小病毒毒株进行分子遗传进化学分析,结果表明,CPV YBYJ株与亚洲地区的毒株的亲缘关系最近,YBYJ株与CPV,SICHUAN（MH476590）的同源性最高,为99%。与GeneBank中发表的其它细小病毒毒株进行分子遗传进化学分析,结果表明,CPVYBYJ株与猫细小病毒（FPV）的亲缘关系最近,基因组同源性是98.6%,与马细小病毒（EqPV）的亲缘关系最远,基因组同源性仅为35.1%。

本试验应用CPV YBYJ强毒株在体外感染MDCK宿主细胞,通过光学显微镜和荧光倒置显微镜观察到MDCK细胞被CPV感染后出现变圆、坏死和脱落等典型的细胞病变效应（CPE）。随着CPV感染时间延长,细胞活性逐渐降低,具有一定的时间依赖性。

本试验成功建立CPV感染MDCK宿主细胞模型。通过细胞凋亡一DNA Ladder抽提试剂盒抽提CPV感染MDCK细胞的总DNA。琼脂糖凝胶电泳结果显示明显的DNA Ladder。荧光显微镜下用双色滤光片观察Annexin V-FITC/PI双染法染色的样品,CPV感染48 h时,检测孔内有较多细胞呈现明亮的苹果绿色,部分细胞呈现绿色胞膜包裹着红色的胞核。

分别提取CPV诱导12 h,24 h,36h,48h和60h时MDCK细胞的蛋白,使用酶标仪确定Caspase-3相对活性,Caspase-3活性随着时间延长先升高后降低,并在48 h时达到峰值（p<0.01）。但随着时间继续延长,凋亡作用活性检测指标逐渐减弱。试验结果说明,CPV YBYJ强毒株在体外可以诱导MDCK宿主细胞发生凋亡,诱导作用在感染48 h时最明显,之后随着诱导时间延长,细胞趋于晚期凋亡并且坏死。

参考文献

[1]Molecular and structural changes related to hepatitis E virus antigen and its expression in testis inducing apoptosis in Mongolian gerbil model[J].M.H.Soomro,R.Shi,R.She,Y.Yang,T.Wang,Q.Wu,H.Li,W.Hao.Journal of Viral Hepatitis.2017(8)

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[3]Typing of Canine Parvovirus Strains Circulating in North‐East China[J].H.Zhao,J.Wang,Y.Jiang,Y.Cheng,P.Lin,H.Zhu,G.Han,L.Yi,S.Zhang,L.Guo,S.Cheng.Transboundary and Emerging Diseases.2017(2)

[4]Canine parvovirus NS1 protein exhibits anti-tumor activity in a mouse mammary tumor model[J].Shishir Kumar Gupta,Pavan Kumar Yadav,Ravi Kumar Gandham,A.P.Sahoo,D.R.Harish,Arvind Kumar Singh,A.K.Tiwari.Virus Research.2016

[5]张紫璇.犬细小病毒YBYJ株全基因组克隆及其诱导MDCK细胞凋亡的初步研究[D].延边大学,2019.