WI-38 [WI38]人胚胎肺成纤维细胞的应用

背景^[1-3]

WI-38[WI38]人胚胎肺成纤维细胞是LeonardHayflick建系有限传代细胞系寿命为50±10代（倍增时间24h）来自妊娠3个月的正常胚胎肺组织。该细胞系用于人疫苗制备的人二倍体细胞，培养基中添加TNFα可以加快细胞生长。

WI-38人胚肺成纤维细胞培养步骤：

1）复苏细胞：将含有1mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加入5mL培养基混合均匀。在1000RPM条件下离心5分钟，弃去上清液，补加4-6mL完全培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入培养瓶中培养过夜（或将细胞悬液加入6cm皿中），培养过夜。第二天换液并检查细胞密度。

2）细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。

1、对于贴壁细胞，传代可参考以下方法：

1.弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。

2.加1-2ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培养瓶中，置于37℃培养箱中消化1-2min，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加5ml以上含10%血清的完全培养基终止消化。

3.轻轻吹打细胞，完全脱落后吸出，在1000RPM条件下离心8-10分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养液后吹匀。

4.按5-6ml/瓶补加培养液，将细胞悬液按1：2到1：5的比例分到新的含5-6 ml培养液的新皿中或者瓶中。

应用^[4][5]

用于人Sox2和Nanog基因克隆及其对胎肺成纤维细胞分化的影响研究

选取胎儿肺间质成纤维细胞作为宿主细胞,将测序成功的重组质粒pSG5-Sox2及pSG5-Nanog转染上述宿主细胞,观察干细胞相关基因Sox2和Nanog对于终末分化的体细胞形态及功能是否产生影响。

克隆人Sox2、Nanog基因编码序列,构建pSG5-Sox2及pSG5-Nanog真核表达重组质粒。原代培养胎肺间质成纤维细胞并传代作为宿主细胞,转染重组质粒pSG5-Sox2、pSG5-Nanog后检测目的基因表达,观察并鉴定宿主细胞分化方向。

方法1应用RT-PCR方法分别从4-6周龄流产胎儿脑组织和膀胱癌细胞中扩增出Sox2及Nanog基因编码全序列,琼脂糖凝胶电泳鉴定。

2目的基因片段Sox2及Nanog双酶切纯化后将其分别连接到pSG5表达载体,构成重组质粒pSG5-Sox2、pSG5-Nanog,转化、扩增后进行菌落PCR和双酶切鉴定后测序及序列比对。

3原代培养胎肺成纤维细胞并传代,实验组将重组质粒pSG5-Sox2及pSG5-Nanog用FuGENE HD转染试剂转染胎肺成纤维细胞,以空质粒pSG5用上述方法转染细胞作为空白对照,未转染细胞加入等量的低糖DMEM培养基作为阴性对照,倒置显微镜观察转染前后的细胞形态学变化。

4转染48h后,将3组胎肺成纤维细胞在六孔板中进行爬片,采用RT-PCR方法,免疫细胞化学检测Sox2及Nanog基因表达情况。过表达重组质粒,15-30d后进行角蛋白（广谱）,巢蛋白,胶质纤维酸性蛋白、神经元特异性烯醇化酶免疫细胞化学染色,利用免疫反应对细胞中相应蛋白的表达进行定位。

参考文献

[1]Sox2 Protein Expression is an Independent Poor Prognostic Indicator in Stage I Lung Adenocarcinoma[J].Lynette M.Sholl,Justine A.Barletta,Beow Y.Yeap,Lucian R.Chirieac,Jason L.Hornick.The American Journal of Surgical Pathology.2010(8)

[2]Rapid and efficient reprogramming of human amnion-derived cells into pluripotency by three factors OCT 4/SOX 2/NANOG[J].Hong-xi Zhao,Yang Li,Hai-feng Jin,Li Xie,Chuang Liu,Feng Jiang,Ya-ning Luo,Guo-wu Yin,Yi Li,Jun Wang,Ling-song Li,Yuan-qing Yao,Xiao-hong Wang.Differentiation.2010(2)

[3]Role of SOX2 in maintaining pluripotency of human embryonic stem cells[J].KeikoAdachi,HirofumiSuemori,Shin‐yaYasuda,NorioNakatsuji,EihachiroKawase.Genes to Cells.2010(5)

[4]Embryonic Stem Cell Transcription Factors and D2-40（Podoplanin）as Diagnostic Immunohistochemical Markers in Ovarian Germ Cell Tumors[J].Martin C.Chang,Sara O.Vargas,Jason L.Hornick,Michelle S.Hirsch,Christopher P.Crum,Marisa R.Nucci.International Journal of Gynecological Pathology.2009(4)

[5]孙中帅.人Sox2和Nanog基因克隆及其对胎肺成纤维细胞分化的影响[D].天津医科大学,2012.