精子细胞BWW培养基的应用

背景^[1-3]

精子细胞BWW培养基又称为获能培养液（capacitatingmedium），主要由系列盐离子、酚红、葡萄糖、丙酮酸钠、BSA等以及抗生素组成，每1000ml BWW培养基中含100，000U青霉素钠盐和100mg链霉素，是一种旨在用于广谱动物和人体精子细胞获能处理的常用营养液。其标准化成分配方依据Biggers-Whitten-Whittingham(BWW)研究小组在1971年发表的成果，适合于各种动物和人体精子细胞处理，该试剂经无菌处理。

操作步骤：

1、取干净的精液样本室温放置，使之充分液化。

2、制备精子细胞(仅供参考，不是必须步骤)：

a、上泳法：取一个无菌的15ml锥底离心管，加入1ml液化的精液，在其上方轻轻加入Earle培养液，45°倾斜试管。轻轻竖立试管，取出最上层的1ml液体。加入8ml增补的Earle培养液稀释，弃上清。加入Earle培养液0.5ml重新悬浮细胞，用于精子密度或功能的评估。

b、非连续密度梯度法：取一个无菌的锥底离心管，加入Percoll。轻轻加入3ml 40%的Percoll于Percoll液面上，小心操作，不要打乱两种液体的界面。轻轻加入1-2ml精液于梯度溶液上，弃上清。将管底的精子团重新悬浮于的Earle培养液中，离心，弃上清。加入1mlEarle培养液，重新悬浮。

3、将含有精子细胞的离心管置于37℃含5%CO2、95%空气的细胞培养箱中孵育。如无上述培养箱，可将离心管密封加盖，置于37℃的普通培养箱内孵育。在孵育过程中，大多数活动的精子从精浆中游离到覆盖上面的培养液内。

4、离心精子悬液，使精子细胞密度接近于10×106/ml，将精子重悬于精子细胞BWW培养基中，并在37℃含5%CO2、95%空气的细胞培养箱内孵育。如无上述培养箱，可将离心管密封加盖，置于37℃的普通培养箱内孵育。在孵育过程中，将试管20°倾斜。

应用^[4][5]

用于体外培养对小鼠生精细胞印迹基因H19和IGF2r甲基化状态的影响研究

通过改进培养条件建立一个稳定、高效的小鼠生精细胞体外培养方法,获得更多的单倍体圆形和长形精子细胞。

方法:采用两步酶消化法和差速贴壁法相结合的方法分离生精细胞,以曲细精管来源细胞为饲养层（MSF）,在添加睾酮（T）、卵泡刺激素（FSH）、低浓度（10ng/ml）胶质细胞神经营养因子（GDNF）和表皮生长因子（EGF）的DMEM/F-12培养基中培养生精细胞;采用RT-PCR检测培养前、生精细胞集落形成、出现圆形精子细胞时精母细胞特异性基因P19和单倍体精子细胞特异性基因TP1 mRNA的表达,判断生精细胞增殖和分化情况;同时采用激光共聚焦显微镜（LSCM）进行分选细胞纯度检测。

结果:以MSF为饲养层,在添加T、FSH、低浓度GDNF和EGF的情况下,培养第7 d可见较多的生精细胞克隆并可检测到P19 mRNA表达,第12 d可见较多的圆形精子细胞和个别活动精子以及TP1 mRNA的表达;经LSCM鉴定,分选的单倍体圆形精子细胞纯度为82%。

结论:实验所建立的培养体系是一个高效、稳定的生精细胞体外培养体系;激光共聚焦显微镜可用于初步鉴定单倍体精子细胞。

参考文献

[1]Gdnf signaling pathways within the mammalian spermatogonial stem cell niche[J].Marie-Claude Hofmann.Molecular and Cellular Endocrinology.2008(1)

[2]Developmental acquisition of genome-wide DNA methylation occurs prior to meiosis in male germ cells[J].C.C.Oakes,S.La Salle,D.J.Smiraglia,B.Robaire,J.M.Trasler.Developmental Biology.2007(2)

[3]Regulation of Placental Efficiency for Nutrient Transport by Imprinted Genes[J].E.Angiolini,A.Fowden,P.Coan,I.Sandovici,P.Smith,W.Dean,G.Burton,B.Tycko,W.Reik,C.Sibley,M.Constancia.Placenta.2006

[4]Epigenetic DNA Hypermethylation of the HERP Gene Promoter Induces Down‐regulation of Its mRNA Expression in Patients With Alcohol Dependence[J].Alcoholism:Clinical and Experimental Research.2006(4)

[5]袁韦娜.体外培养对小鼠生精细胞印迹基因H19和IGF2r甲基化状态的影响[D].安徽医科大学,2011.