一种植物核酸酶及其编码基因与应用

背景技术

核酸分解的步是水解核苷酸之间的磷酸二酯键，在高等动植物中都有作用于磷酸二酯键的核酸酶。不同来源的核酸酶，其专一性、作用方式都有所不同。有些核酸酶只能作用于RNA，称为核糖核酸酶（RNase)，有些核酸酶只能作用于DNA，称为脱氧核糖核酸酶（DNase)，有些核酸酶专一性较低，既能作用于RNA也能作用于DNA，因此统称为核酸酶 (nuclease)。

植物中DNase参与衰老、发育过程中的程序性死亡（P⑶）、超敏反应等，很多与DNA 的修复相关。在植物PCD过程中有DNA的损伤和降解，已经陆续检测到和克隆出了该过程有关的DNase。在西红柿的叶衰老过程中检测到了两个nuclease。百日草中克隆到ZEW， 认为ZEm是直接参与管状分子PCD的DNase。在小麦的糊粉层细胞凋亡中发现了定位在核内的GA诱导的nuclease。从拟南芥中克隆到DNaseBFNl，可能和叶的衰老过程有关。DNase 可以根据依赖离子的不同分类，也可以根据对底物的偏好分类。

拟南芥的CAN基因在2000年被克隆，已证明CAN有依赖钙离子的DNase活性，但是缺乏深入的功能分析。CAN与葡萄球菌细胞外核酸酶类似，有一个SNc结构域，它的酶活性可被锌离子抑制，在细菌中已经发现很多与葡萄球菌细胞外核酸酶同源的基因，例如， Shigella flexneri中pSa质粒上的nuc基因，大肠杆菌中RP4质粒上的parB基因。高等植物中个与葡萄球菌同源的DNase基因在紫堇属（Corydalis sempervirens)中发现，植物中其他同源的基因陆续被克隆，现已经从烟草、杨树、水稻等多种植物中找到该类基因。

虽然已克隆到很多DNase，但它们在植物P⑶过程中所起的作用，所处的地位尚不明确，与动物相比，植物PCD过程的研究仍然处于起步阶段。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种核酸酶及其编码基因。

本发明所提供的核酸酶，名称为CsCaN，来源于黄瓜，是如下（a)或（b)的蛋白质：

(a)由序列表中序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

(b)将序列3的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有核酸酶活性的由序列3衍生的蛋白质。

序列表中的序列3由334个氨基酸残基组成，自序列3的氨基末端第220-330位氨基酸残基是保守的SNc结构域。

所述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加是指在序列3的SNc结构域外进行取代和/或缺失和/或添加。

为了使（a)中的CsCaN便于纯化，可在由序列表中序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。

表1标签的序列

黄瓜核酸酶CsCaN的筛选及其cDNA的克隆

因为黄瓜雌花雄蕊在特定的时期开始出现花药特异的DNA损伤，并且检测到该过程中有DNase活性物质存在，推测可能DNase导致DNA的损伤的发生，从而引起雄蕊原基的滞育，产生单性花，那么这个导致DNA损伤的DNase基因就是一个关键的执行分子，很值得研究。在黄瓜雌花雄蕊的发育过程中，一定有很多基因参与这个发育调控的过程，所以通过克隆发育调控的基因，解析这一过程。

通过抑制消减杂交找到差异表达的基因，得到一系列基因，然后再筛选符合预期的基因，找到DNase的EST，EST序列如序列表中的序列1所示。

根据EST序列设计引物如下：

3，RACE 引物

Nucleases' racel 5，GCTGAGGCTTGGAAGACGGAGAA 3，

Nucleases' race2 5’ CAGACGCTGCCAGTTGATGCC 3’

Nucleases' race3 5，AAGACAATCACGGATGCTGGTTACA 3，

5，Race 引物

Nuclease 5， race3 3， AACCGACTCCGAACCTTCTGCCTC 5，

Nuclease 5， race2 3， CTGCGACGGTCAACTACGGTTTCG 5，

Nuclease 5’ racel 3’ TCGTGTAGTGTGGGCTCTCTCAGGAG 5’

反转录引物 Nuclease 5，raceRT 3，TTACTCCTCCAAGAA 5，

利用带oligo dT的反转录引物反转录合成链cDNA，用通用引物和上面的三个PCR引物顺序进行嵌套PCR，对最终得到的产物进行测序，得到全长的CsCaNcDNA序列。 PCR流程见CL0NTHCH公司SMART-RACE试剂盒。

用Trizol (invitrogen)提取中农五号（中国农科院蔬菜花卉研究所）黄瓜花的总RNA，用superscriptll(invitrogene)反转录酶反转录获得到cDNA。根据全长的CsCaN cDNA序列，设计引物Pl和P2。以反转录得到的cDNA为模板，用引物Pl和P2进行PCR扩增。引物Pl和P2的序列如下：

Pl :5，-ct-gaaggatttc-ATGGGAAACGCACTCAGGT-3，， P2 ： 5，-ca-gtcgac-TTATTTCCCCTCACGCTTTC-3，。

对PCR产物进行0.8%琼脂糖凝胶电泳检测，得到分子量约为Ikb的条带，与预期结果相符。用琼脂糖凝胶回收试剂盒（TIANGEN)回收该片段。将该回收片段与PGEM-T Easy (Promega)连接，参照 Cohen 等的方法（Proc Natl Acad Sci，69 :2110)，将连接产物转化大肠杆菌DH5 α感受态细胞，根据pGEM-T Easy载体上的氨卞青霉素抗性标记筛选阳性克隆，得到含有回收片段的重组质粒。以该重组质粒载体上的T7和SP6启动子序列为引物对其进行核苷酸序列测定，测序结果表明扩增到的CsCaN基因由1005个脱氧核糖核苷酸组成，其开放阅读框（ORF)为序列表中序列2的自5'末端第1至1005位脱氧核糖核苷酸，编码氨基酸序列是序列表中序列3的蛋白质。将含有序列表中序列2的自5'末端第1-1005 位脱氧核糖核苷酸的CsCaN基因的重组载体命名为pTE-CsCaN。

利用软件分析CsCaN的等电点和分子量，结果表明pi = 9. 55 ；Mw = 37454. 75。自序列3的氨基末端第220位-330位为SNc结构域。然后根据⑶S序列，设计基因两端的序列进行PCR得到基因组DNA序列（序列表中序列4)。该序列含有9个外显子，8个内含子。