DNA酶的应用

背景及概述^[1]

DNA酶是水解DNA的一类核酸酶，包括内切酶 (DNase I和限制性内切酶)与外切酶(外切酶Ⅲ、Ⅶ)。DNA酶广泛存在于多种哺乳动物、虾类、昆虫和植物中，对于个体的发育、细胞正常的老化凋亡、以及防御系统的构建具有重要的生物学功能。DNA酶是一种多功能核酸内切酶,可以以非特异性的方式切割DNA,作用于两个脱氧核糖核苷酸之间的3',5'-磷酸二酯键，将DNA链切割开并将其降解成单个核苷酸或寡聚核苷酸。其中研究最多的是哺乳动物和人类的DNA酶，例如来源于牛胰腺的DNase I被广泛应用于生物学研究和医学分子检测试剂盒，而来源于人的重组DNaseI还被应用于一些疾病的治疗，例如囊肿性纤维化(cystic fibrosis,CF)、肺不张和复杂性肺炎伴胸腔积液和脓胸等。

制备^[3]

近些年来的研究发现，DNA酶也是昆虫防御系统的重要组成部分，例如对黄蜂毒液 的主要成分进行分析，发现包括组胺、五羟色胺、蛋白酶、缓激肽、DNA酶和透明质酸酶等。相 对于人和哺乳动物的DNA酶，昆虫的DNA酶相关的研究相对较少，对它们的活性研究以及应用实例也处在相对缺乏的状态。

CN201810526954.4公开了一种全新的短管赤眼蜂DNA酶，将编码短管赤眼蜂全新DNA酶的基因 序列进行密码子优化以后，合成并导入毕赤氏酵母表达系统中，通过发酵条件的优化，实现 了新DNA酶的高效表达，体外DNA降解实验表明，短管赤眼蜂DNA酶能有效降解双链DNA，其活 性与来源于牛胰腺的DNase I相当，并且其活性高度依赖于二价镁离子(Mg2+)，加入高于镁 离子浓度的螯合剂EDTA后可有效抑制其酶活，具体方案如下：所述短管赤眼蜂DNA酶的氨基酸序列和编码该氨基酸序列的核苷酸序列分别为SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2。本发明第二个方面公开了一种生产上述的短管赤眼蜂DNA酶的方法，包括以下步骤：

S1:将短管赤眼蜂基因LOC111693613(Genbank accession number: LOC111693613)进行密码子优化；

S2：将S1得到的核苷酸序列克隆到重组质粒进行基因扩增；

S3：将S2得到的基因片段导入表达载体得到重组表达载体；

S4：将S3中得到的重组表达载体转化入毕赤氏酵母的感受态细胞中；

S5：将S4中转化成功的感受态细胞进行筛选，得到高产量表达短管赤眼蜂DNA酶的 毕赤氏酵母菌株Pichia-TPDNase；

S6：将S5中得到的毕赤氏酵母菌株Pichia-TPDNase进行大规模培养，分离纯化发 酵液得到短管赤眼蜂DNA酶。

应用^[4]

人体内的钾是维持细胞生理活动的主要阳离子，是保持机体的正常渗透压及酸碱平衡，参与糖及蛋白质代谢，保证神经肌肉的正常功能所必需，其含量是人 体生理活动的重要指标。尿液、血清中钾离子的含量水平在临床上可用了诊断一 些肾脏、心脏等方面的疾病。

CN201510031940.1提供一种基于DNA酶检测钾离子浓度的方法。包括下述：

(1)配制标准溶液DNA酶体系

用含钠离子的缓冲液溶解可溶性钾盐配置多个浓度梯度的钾离子溶液，分别向每个浓度梯度的钾离子溶液中加入DNA，得到多个DNA含量相同的钾离子-DNA体系；所述多个DNA含量相同的钾离子-DNA体系反应后，得到多个构象不同的DNA G-四 链体的体系，分别向各个所述DNA G-四链体的体系中加入氯化血红素，得到氯化血 红素含量相同的多个DNA G-四链体-氯化血红素体系，所述多个DNA G-四链体-氯化 血红素体系反应后，得到多个标准溶液DNA酶体系；所述DNA为能够形成G-四链体的DNA；

(2)配制待测溶液DNA酶体系

将待测样品加入到所述含钠离子的缓冲液，得到待测样品溶液，向所述待测样品 溶液中加入所述DNA，得到待测样品-DNA体系，所述待测样品-DNA体系中所述DNA 的含量与所述多个DNA含量相同的钾离子-DNA体系中所述DNA的含量相同；所述 待测样品-DNA体系反应后，得到DNA G-四链体的体系，向该体系中加入氯化血红素， 反应后，得到DNA G-四链体-氯化血红素体系，所述DNA G-四链体-氯化血红素体系 中的氯化血红素含量与所述多个DNA G-四链体-氯化血红素体系中的氯化血红素含量 相同；所述DNA G-四链体-氯化血红素体系反应后，得到待测溶液DNA酶体系；

(3)标准溶液及待测溶液的配制

将2,2′-联氨-双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二胺盐ABTS溶液与H₂O₂混合，得到混合液，将该混合液称为底物溶液，向所述多个标准溶液DNA酶体系中的每一个标 准溶液DNA酶体系中加入所述底物溶液进行反应，得到多个标准溶液样本；向所述待测溶液DNA酶体系中加入所述底物溶液进行反应，得到待测溶液样本；

(4)标准曲线的制备

测量所述多个标准溶液样本在420nm处的吸光度，绘制钾离子浓度与吸光强度值的标准曲线；

(5)待测样本检测

测量所述待测溶液样本在420nm处的吸光度，根据所述标准曲线，得到所述待测样品中钾离子的浓度。

主要参考资料

[1] 兽医大辞典

[2] CN201680012991.2 修饰的DNA酶及其用途

[3] CN201810526954.4 一种短管赤眼蜂DNA酶及其生产方法和应用

[4] CN201510031940.1 一种基于DNA酶检测钾离子浓度的方法