L-亮氨酸的发酵生产方法

背景及概述^[1]

L-亮氨酸(L-leucine)又称白氨酸，即α-氨基-γ-甲基戊酸、α-氨基异己酸，分子式为C6H13O2N。1819年Proust首先从奶酪中分离得到，后来Braconnot从肌肉与羊毛的酸水解物中得到结晶，并定名为亮氨酸。亮氨酸与缬氨酸、异亮氨酸同属于支链氨基酸，是人体八大必需氨基酸之一。L-亮氨酸具有多种生理功能，在医药、食品、化妆品、农业等方面应用广泛。

制备^[1]

一种发酵生产L-亮氨酸的方法

(1)活化培养：取L-亮氨酸生产菌(即谷氨酸棒杆菌ACCC16522，购自上海复祥生物科技有限公司)接种至活化培养基上，在培养箱中32℃活化培养12h，得到活化菌。

活化培养基：无水葡萄糖1g/L、蛋白胨10g/L、牛肉膏10g/L、酵母膏5g/L、NaCl2.5g/L、琼脂粉20g/L，pH＝7.0-7.2。

(2)种子培养：取一环生长良好的活化菌接种至含有种子培养基的摇瓶中进行种子培养，装液量为200mL/500mL，种子培养的条件为32℃，150r/min摇床培养20h，用分光光度计测定发酵液中的菌体浓度，菌体OD620值达到1.2可作为合格的种子液，得到种子液。

种子培养基：无水葡萄糖20g/L、玉米浆干粉25g/L、硫酸铵2g/L、KH₂PO₄·3H₂O1.5g/L、维生素B1 300μg/L、生物素200μg/L，pH＝7.0-7.2。

(3)发酵培养：按照10％的接种量，取步骤(2)得到的种子液，接种至含有发酵培养基的10L发酵罐中，装液量为6L/10L，培养温度为30℃-35℃，搅拌转速600rpm/min，在培养过程中加入补料培养基，前12h的通气量为80-100L/h，12h之后的通气量为100-120L/h，通过自动流加氨水控制发酵过程中pH＝6.6±0.05，培养30-32h，得到发酵液。发酵结束时间以产酸不再增加为判断标准。发酵培养前后，用高效液相色谱法测定L-亮氨酸含量；利用生物传感分析仪检测发酵液残糖的含量。

发酵培养基：苹果酸钠2.0-4.0g/L、无水葡萄糖140-160g/L、玉米浆干粉35g/L、硫酸铵20g/L、KH₂PO₄·3H₂O 1.0g/L、MgSO₄·7H₂O 0.4g/L、MnSO₄·H₂O 0.1g/L、维生素B1 300μg/L、生物素50μg/L、CaCO₃ 30g/L、消泡剂0.5％，pH＝7.0-7.2。

补料培养基：苹果酸钠1.0g/L、肌醇1.0-2.0g/L、玉米浆干粉12g/L、硫酸铵25g/L、KH₂PO₄·3H₂O 2.0g/L、MgSO₄·7H₂O 0.6g/L、MnSO₄·H₂O 0.3g/L、维生素B1 400μg/L、生物素60μg/L、CaCO₃ 20g/L、消泡剂1.0％，pH＝7.0-7.2。

(4)L-亮氨酸的提取：取发酵结束后的发酵液，8000r/min离心10min，收集上清液，将上清液过离子交换柱提取纯化，0.5BV/h流速上样，上样量为260mL的发酵液，所用洗脱剂为3.0mol/L的氨水，洗脱流速为0.1-1.0BV/h，收集流出液，用高效液相色谱法测定发酵液和流出液中L-亮氨酸的含量，计算得率。

参考文献

[1] [中国发明,中国发明授权] CN201910065390.3 一种发酵生产L-亮氨酸的方法