人烟酰胺磷酸核糖基转移酶(NAMPT)ELISA试剂盒的应用

背景^[1-3]

人烟酰胺磷酸核糖基转移酶(NAMPT)ELISA试剂盒采用双抗体一步夹心法酶联免疫吸附试验（ELISA）检测人烟酰胺磷酸核糖基转移酶(NAMPT)的体外浓度。往预先包被人烟酰胺磷酸核糖基转移酶(NAMPT)捕获抗体的包被微孔中，依次加入标本、标准品、HRP标记的检测抗体，经过温育并彻底洗涤。用底物TMB显色，TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的人烟酰胺磷酸核糖基转移酶(NAMPT)呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），计算样品浓度。

烟酰胺磷酸核糖转移酶（NAMPT）是烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD）生物合成途径的关键限速酶，也被称为内脏脂肪素（Visfatin）或前B细胞克隆增强因子（PBEF）.它通过调节机体或细胞的NAD水平以及通过其他非酶机制等途径影响代谢、炎症反应、细胞的增殖、分化和凋亡，特别是衰老等诸多过程。

实验操作：

1.标准品的稀释与加样

2.加样：分别设空白孔（空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同）、待测样品孔。在酶标包被板上待测样品孔中先加样品稀释液40μl，然后再加待测样品10μl（样品最终稀释度为5倍）。加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀。

3.温育：用封板膜封板后置37℃温育30分钟。

4.配液：将30（48T的20倍）倍浓缩洗涤液用蒸馏水30（48T的20倍）倍稀释后备用。

5.洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去，如此重复5次，拍干。

6.加酶：每孔加入酶标试剂50μl，空白孔除外。

7.温育：操作同3。

8.洗涤：操作同5。

9.显色：每孔先加入显色剂A50μl，再加入显色剂B50μl，轻轻震荡混匀，37℃避光显色15分钟.

10.终止：每孔加终止液50μl，终止反应（此时蓝色立转黄色）。

11.测定：以空白空调零，450nm波长依序测量各孔的吸光度（OD值）。测定应在加终止液后15分钟以内进行。

应用^[4][5]

用于NAD补救合成途径的关键酶NAMPT和NAPRT与结直肠癌患者预后的关系研究

烟酰胺磷酸核糖基转移酶（NAMPT）和烟酸酯磷酸核糖基转移酶（NAPRT）是NAD补救生物合成途径的关键酶,它们相互合成NAD,从而提供了NAD生物合成的主要来源。然而,NAMPT和NAPRT在结直肠癌（CRC）中的预后价值不清楚。

方法收集临床病例,并通过5年随访获得临床病例资料。收集261例患者的手术后组织制作组织芯片,运用免疫组化技术研究了CRC癌组织和癌旁组织中NAMPT和NAPRT蛋白的表达。

应用生物信息学的技术和方法搜集公共数据库资料,运用UALCAN、PROGgnesV2、cBioportal、TargetScan等在线分析软件分析NAPRT/NAMPT在CRC中的表达、突变、扩增、启动子甲基化等情况,以及对CRC预后的影响。对NAPRT/NAMPT的相关基因进行了KEGG通路分析。

采用细胞实验,PCR,WesternBlot,CCK-8,Tanswell等方法,研究了NAMPT在CRC体外的功能。结果我们发现,NAPRT和NAMPT在CRC组织中高表达,NAPRT或NAMPT的高表达与CRC中的血管浸润、浸润深度和晚期TNM分期有关。

NAPRT或NAMPT的高表达预示了CRC患者较短的总体生存期和无病生存时间。此外,NAMPT和NAPRT在CRC组织中的表达呈正相关关系。NAPRThigh/NAMPThigh患者生存时间最短。

参考文献

[1]Nicotinamide phosphoribosyl transferase regulates cell growth via the Sirt1/P53 signaling pathway and is a prognosis marker in colorectal cancer[J].Jing‐hua Pan,Hong Zhou,Sheng‐Bin Zhu,Jin‐Lian Huang,Xiao‐Xu Zhao,Hui Ding,Li Qin,Yun‐Long Pan.Journal of Cellular Physiology.2019(4)

[2]microRNA-300/NAMPT regulates inflammatory responses through activation of AMPK/mTOR signaling pathway in neonatal sepsis[J].Yexuzi Li,Junzhong Ke,Chen Peng,Fugen Wu,Yukang Song.Biomedicine&Pharmacotherapy.2018

[3]NAD metabolism:Implications in aging and longevity[J].Keisuke Yaku,Keisuke Okabe,Takashi Nakagawa.Ageing Research Reviews.2018

[4]Global cancer statistics 2018:GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries[J].Freddie Bray BSc,MSc,PhD,Jacques Ferlay ME,Isabelle Soerjomataram MD,MSc,PhD,Rebecca L.Siegel MPH,Lindsey A.Torre MSPH,Ahmedin Jemal PhD,DVM.CA:A Cancer Journal for Clinicians.2018(6)

[5]李晓琴.NAD补救合成途径的关键酶NAMPT和NAPRT与结直肠癌患者预后的关系研究[D].重庆医科大学,2020.