人抗乙型肝炎病毒表面抗体(HBSAB)ELISA试剂盒的应用

背景^[1-3]

人抗乙型肝炎病毒表面抗体(HBSAB)ELISA试剂盒采用间接法酶联免疫吸附试验（ELISA）。往预先包被人抗乙型肝炎病毒表面抗体（HBsAb）捕获抗原的包被微孔中，依次加入标本、标准品、HRP标记的检测抗体，经过温育并彻底洗涤。用底物TMB显色，TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的人抗乙型肝炎病毒表面抗体（HBsAb）呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），计算样品浓度。

样本处理及要求：

1.血清：全血标本请于室温放置2小时或4℃过夜后于1000g离心20分钟，取上清即可检测，或将标本放于-20℃或-80℃保存，但应避免反复冻融。

2.血浆：可用EDTA或肝素作为抗凝剂，标本采集后30分钟内于2-8°C 1000g离心20分钟，或将标本放于-20℃或-80℃保存，但应避免反复冻融。

3.细胞培养物上清或其它生物标本：1000g离心20分钟，取上清即可检测，或将标本放于-20℃或-80℃保存，但应避免反复冻融。

操作步骤：

1.从室温平衡20min后的铝箔袋中取出所需板条，剩余板条用自封袋密封放回4℃。

2.设置标准品孔和样本孔，标准品孔各加不同浓度的标准品50μL；

3.样本孔中加入待测样本50μL；空白孔不加。

4.除空白孔外，标准品孔和样本孔中每孔加入辣根过氧化物酶（HRP）标记的检测抗体100μL，用封板膜封住反应孔，37℃水浴锅或恒温箱温育60min。

5.弃去液体，吸水纸上拍干，每孔加满洗涤液（350μL），静置1min，甩去洗涤液，吸水纸上拍干，如此重复洗板5次（也可用洗板机洗板）。

6.每孔加入底物A、B各50μL，37℃避光孵育15min。

7.每孔加入终止液50μL，15min内，在450nm波长处测定各孔的OD值。

应用^[4][5]

用于人源抗乙型肝炎病毒表面抗原（HBsAg）基因工程抗体的研究

人源抗乙型肝炎病毒表面抗原全抗体表达及功能鉴定在利用原核细胞XL1-Blue表达Fab抗体的基础上,分别利用哺乳动物瞬时表达系统和杆状病毒-昆虫细胞技术平台实现了全抗体的真核分泌表达。

将筛选出的20株抗体中具有高滴度6株Fab抗体的轻链和重链Fd段基因插入杆状病毒载体pAc-L-FcR中,然后将构建完成的重组质粒与杆状病毒重组后转染昆虫细胞,同时将其轻重链可变区基因插入HL51-14哺乳动物细胞表达载体后,转染293T细胞。

通过直接免疫荧光检测真核表达效果,收集昆虫细胞和哺乳动物细胞表达上清进行亲和层析纯化。利用SDS-PAGE检测纯化后抗体的纯度、ELISA方法检测纯化后的抗HBsAgIgG全抗体的功能活性,结果表明纯化后的人源HBsAg单克隆抗体抗体纯度达到98%以上,并且具有良好的生物活性。

参考文献

[1]Epidemiology of Hepatitis Virus B and C[J].Archives of Medical Research.2007(6)

[2]Mechanism of viral persistence and resistance to nucleoside and nucleotide analogs in chronic Hepatitis B virus infection[J].Fabien Zoulim.Antiviral Research.2004(1)

[3]Baculovirus expression cassette vectors for rapid production of complete human IgG from phage display selected antibody fragments[J].Mifang Liang,Stefan Dübel,Dexin Li,Iris Queitsch,Wei Li,Ekkehard K.F Bautz.Journal of Immunological Methods.2001(1)

[4]Efficacy and limitations of a specific immunotherapy in chronic hepatitis B[J].Journal of Hepatology.2001(6)

[5]刘洋.人源抗乙型肝炎病毒表面抗原（HBsAg）基因工程抗体的研究[D].中国疾病预防控制中心,2012.