上皮细胞培养基 EPICM的应用

背景^[1-3]

上皮细胞培养基EPICM是专门为正常人类上皮细胞体外培养设计的最适于其生长的培养基。上皮细胞培养基EPICM是是经灭菌的液体培养基，包含必需和非必需氨基酸、维生素、有机和无机化合物、激素、生长因子、微量矿物质和低浓度胎牛血清(2%)。

该培养基缓冲体系为重碳酸盐，在含5%CO2的细胞培养箱中平衡后pH值为7.4。该培养基的配方能够选择性的促进正常人类微血管内皮细胞体外培养中的增殖和生长，并为其达到最理想营养平衡状态。

上皮细胞培养基包含500 ml基础培养基，10mll胎牛血清、5ml上皮细胞生长因子、5 ml青霉素/链霉素溶液。

使用步骤：

1．取材：取外科植皮或手术残余皮肤小块，以角化层薄者为佳，早产流产儿皮肤更好，切成0.5～1平方厘米小块。

2．EDTA处理：先置入0.02%EDTA中室温置5分钟。

3．冷消化：换入0.25%胰蛋白酶中，置4℃过夜。

4．分离：取出皮肤，用血管钳或镊子把表皮与真皮层分开。

5．温消化：取出表皮单独处理，用剪刀剪成更小的块后，置入新的0.25%胰蛋白酶中，37℃再消化30～60分钟。

6．用吸管轻轻反复吹打，使成细胞悬液。

7．培养液：通过80目不锈钢纱网滤过后，低速离心，吸上清，直接加入Eagle液和20%小牛血清，制成细胞悬液，接种入碟皿中，CO2温箱培养。

应用^[4][5]

用于肿瘤转移相关基因1（MTA1）在食管癌细胞上皮间质转化过程中的促进作用干细胞培养基成球培养法筛选宫颈癌干细胞的生物学特性鉴定

探讨MTA1基因对食管癌细胞上皮间质化(EMT)过程的影响及分子机制。

方法采用慢病毒感染方法建立MTA1敲降的食管癌细胞系LV3-shMTA1-KYSE410及MTA1过表达食管癌细胞系LV5-MTA1-KYSE450;通过Western Blot方法检测上述食管癌细胞系中MTA1蛋白及EMT相关蛋白的表达水平；进而采用免疫荧光实验检测上述食管癌细胞系中EMT相关蛋白分子标志物E-cadherin和Vimentin的定位以及表达水平的变化。

应用划痕实验明确MTA1表达水平改变后对食管癌细胞迁移能力的影响；在LV3-shMTA1-KYSE410细胞中过表达SOX2观察对敲降MTA1的KYSE410细胞EMT的影响；采用免疫组织化学方法检测食管癌组织中MTA1和SOX2的表达情况,分别统计分析二者的临床病理参数及预后的相关性,并探讨MTA1和SOX2分子表达的相关性。

结果食管癌KYSE450细胞系过表达MTA1后,EMT相关蛋白标志物中的E-cadherin表达水平降低而Vimentin表达水平升高,迁移能力增强；食管癌KYSE410细胞系敲降MTA1后,E-cadherin表达水平升高而Vimentin表达水平降低,迁移能力降低,差异均具有统计学意义(P<0.05)=LV3-shMTA1-KYSE410细胞过表达SOX2后能够恢复由于MTA1的敲降所引起的E-cadherin表达水平的升高、Vimentin表达水平的降低以及迁移能力的减弱。

通过免疫组化结果分析得出,MTAl和SOX2在肿瘤组织中的表达强度均高于正常组织(p<0.05)。MTA1和SOX2的表达强度均与淋巴结转移相关(p<0.05)。MTA1阳性、SOX2阳性及二者共同阳性表达的患者的生存时间均短于阴性表达的患者(p<0.05)。

参考文献

[1]Crk-like adapter protein regulates CCL19/CCR7-mediated epithelial-to-mesenchymal transition via ERK signaling pathway in epithelial ovarian carcinomas[J].Shaomei Cheng,Jingyan Guo,Qing Yang,Xiangshan Yang.Medical Oncology.2015(3)

[2]CCR7 pathway induces epithelial–mesenchymal transition through up-regulation of Snail signaling in gastric cancer[J].Jianping Zhang,Yunzhe Zhou,Yonggang Yang.Medical Oncology.2015(2)

[3]Curcumin suppresses proliferation and invasion in non-small cell lung cancer by modulation of MTA1-mediated Wnt/β-catenin pathway[J].Yimin Lu,Changjiang Wei,Zhaoqing Xi.In Vitro Cellular&Developmental Biology-Animal.2014(9)

[4]Endothelial cells promote stem‐like phenotype of glioma cells through activating the Hedgehog pathway[J].Guang‐Ning Yan,Lang Yang,Yang‐Fan Lv,Yu Shi,Li‐Li Shen,Xiao‐Hong Yao,Qiao‐Nan Guo,Peng Zhang,You‐Hong Cui,Xia Zhang,Xiu‐Wu Bian,De‐Yu Guo.J.Pathol..2014(1)

[5]刘欢.肿瘤转移相关基因1（MTA1）在食管癌细胞上皮间质转化过程中的促进作用干细胞培养基成球培养法筛选宫颈癌干细胞的生物学特性鉴定[D].北京协和医学院,2015.