M199 (with HEPES)的应用

背景^[1-3]

M199(with HEPES)即培养基199，是Morgan等在1950年设计的，最初用于鸡胚成纤维细胞的营养研究，现已广泛应用于各种动物细胞的培养，包括一些非哺乳类动物细胞。M199特别适用于非转化细胞的培养，也常用于病毒学、疫苗生产，以及大鼠胰腺上皮细胞和小鼠晶状体组织的培养。

与其他基础培养基相比，M199含有独特的成分，包括腺嘌呤、腺苷、次黄嘌呤、胸腺嘧啶、以及其他的维生素。M199有两种平衡盐成分，Earle's盐成分常用于CO2环境，Hank's盐成分用于非CO2的环境。

HEPES是一种优良的生物缓冲剂，对细胞无毒性作用，添加HEPES的培养基能够较长时间保持恒定的PH范围，可以有效的防止培养液PH波动较大对细胞生长产生不利的影响。

L-谷氨酰胺（Glutamine）是细胞培养中所必需的一种营养元素，但其在溶液中不稳定，会自发降解，不含L-谷氨酰胺的培养基，可以根据研究需要任意调整L-谷氨酰胺的用量，在使用时添加新鲜的L-谷氨酰胺或其替代物更利于细胞的生长。

M199(with HEPES)含有多类细胞培养所需的氨基酸、维生素、无机盐等多种成分，但不含蛋白质、脂类或任何生长因子，故此产品需搭配血清或无血清添加物使用。

应用^[4][5]

用于人脐血内皮祖细胞的分离、培养和鉴定及改良冻融法脱细胞血管支架的建立

采用6%羟乙基淀粉沉降法和percoll非连续性密度梯度离心法，在新鲜人脐血中进行内皮祖细胞（EPCs）分离，并将分离出的细胞纯化，在体外进行进一步的培养和增殖。采用相关抗原免疫染色对所培养的人脐血内皮祖细胞进行鉴定。

以进一步探寻简化的实验步骤，如何获得足量内皮祖细胞的实验方法，并为实验课题提供充足、健康的内皮祖细胞来源，为下一步实验准备充足的细胞来源。同时，深入探讨人脐血中分离并大量培养内皮祖细胞的可行性以及临床应用价值。

收集足月剖腹产手术胎儿脐带血，无菌条件下放置于含有50U/ml肝素的血清瓶中，放置于4°C冰盒中保存，运送至细胞培养室，采用密度梯度离心法来获取脐带血单个核细胞，将获取的单个核细胞分成两份，加入胎牛血清M199培养基（FCS-M199）及自体血清M199培养基（AS-M199），并分别将其接种于铺设有人纤维连接蛋白（HFN）和未铺设有人纤维连接蛋白的培养皿中（标记为：F（0）、F（1）、A（0）、A（1））进一步进行体外诱导、分化以及扩增。

并观察贴壁细胞在整个诱导分化过程中的形态学变化，结合免疫组化、免疫荧光以及流式细胞仪等相关技术从不同角度对其进行鉴定。

研究结果：（1）培养12d后，脐血单个核细胞开始出现贴壁。而在3d之后纺锤形状开始出现，此后贴壁细胞数量逐渐增多，且逐渐变成梭形。当培养至一周时，则形成周围为梭形细胞，而在中央是圆形细胞的典型集落。而在细胞培养至14d时，则出现了互相连接的细胞簇逐渐连接并形成网样结构。与此同时，随着培养时间的不断增加，长梭形细胞也开始逐渐缩短，并呈典型铺路石样改变。

（2）贴壁细胞培养至一周之后继续观察，在铺设有人纤维连接蛋白的培养基之内的细胞数量明显较没有铺设人纤维连接蛋白的多，而在两种不同培养基的细胞数量上无明显变化。

参考文献

[1]Engineering extracellular matrix structure in 3D multiphase tissues[J].Brian M.Gillette,Ninna S.Rossen,Nikkan Das,Debra Leong,Meixin Wang,Arushi Dugar,Samuel K.Sia.Biomaterials.2011(32)

[2]Calcific myonecrosis of the lower leg:diagnosis and options of treatment[J].Keiichi Muramatsu,Koichiro Ihara,Toshihiro Seki,Takashi Imagama,Toshihiko Taguchi.Archives of Orthopaedic and Trauma Surgery.2009(7)

[3]Bioengineered Three-Layered Robust and Elastic Artery Using Hemodynamically-Equivalent Pulsatile Bioreactor[J].Kiyotaka Iwasaki,Koji Kojima,Shohta Kodama,Ana C.Paz,Melody Chambers,Mitsuo Umezu,Charles A.Vacanti.Circulation.2008(14 S)

[4]Application of elastic salmon collagen gel to uniaxial stretching culture of human umbilical vein endothelial cells[J].Toshiyuki Kanayama,Nobuhiro Nagai,Kazuo Mori,Masanobu Munekata.Journal of Bioscience and Bioengineering.2008(5)

[5][1]曹程程.人脐血内皮祖细胞的分离、培养和鉴定及改良冻融法脱细胞血管支架的建立[D].蚌埠医学院,2013.