人间充质干细胞无血清培养基的应用

背景^[1-3]

人间充质干细胞无血清培养基是一种人间充质干细胞无血清培养基，所述培养基的主要成分包括基础培养基和添加物。

基础培养基为a-MEM，L-DMEM，或DMEM-F12中任一种。

添加物包括人血白蛋白(HSA），胰岛素-转铁蛋白-硒添加剂（ITS），氢化可的松，维生素C（Vc），亚油酸，孕酮，丙酮酸钠，非必需氨基酸，必需氨基酸，碱性成纤维生长因子（bFGF），转化生长因子（TGF-β)。

无血清培养基中HSA的添加量为100-1000μg/L，ITS的添加量为1-10ml/L，维生素C的添加量为10-30mg/L，氢化可的松添加量为10-50μg/L，亚油酸的添加量为1-10mg/L，丙酮酸钠的添加量为50-150mg/L，孕酮的添加量为1-25μg/L，非必需氨基酸的添加量为10-20ml/L，必需氨基酸的添加量为10-20ml/L，bFGF的添加量为1-10μg/L，TGF-β的添加量为1-10μg/L。

传统培养间充质干细胞的培养基普遍由基础培养基和胎牛血清（FBS）构成。FBS中含有细胞生长所需的生长因子、激素、载体蛋白、贴壁因子、微量元素以及其他营养物质，可以促进细胞的生长。

但FBS的添加也会产生一些问题或隐患：1）FBS易受病毒，支原体和其他病原体的污染，容易导致干细胞生产过程中发生污染；2）FBS的成分多样且复杂，目前对其成分、含量及其作用机制仍不清楚，有些可能对干细胞的生长产生抑制或毒害作用；3）FBS都是批量生产，各批次间的质量差异造成干细胞终产品批次间的质量差异；4）FBS中的某些成分难以彻底去除，严重影响最终产品质量，具有安全隐患。

应用^[4][5]

用于人胚胎干细胞诱导分化为成熟红细胞的关键技术研究

通过实验研究解决其中两个关键性技术问题,实现安全低成本的扩增hES细胞和体外无血清培养体系下高效率的扩增红系祖细胞并向脱核红细胞分化。希望通过解决以上两个关键技术问题使hES细胞向成熟红细胞分化能够更安全、高效,为最终诱导hES细胞分化为成熟红细胞解决临床输血治疗面临的问题奠定实验基础。

利用bFGF-hFLSCs作为人源化饲养层细胞体外扩增hES细胞hES细胞建系和常规培养都是用小鼠胚胎成纤维细胞(mouse embryonic fibroblasts,MEF)做饲养层细胞或用MEF条件培养基(MEF conditional medium,MEF-CM)添加细胞因子在无饲养层条件下培养hES细胞,这种异基因来源的饲养层给hES细胞的应用带来很大的安全风险。

为避免动物源性饲养层可能带来的污染,分离获得了14周胎龄的人胎肝基质细胞系(human fetal liver stromal cells,hFLSCs),其在体外可以长期培养扩增,能够传代35次仍保持正常的核型,形态学及其表面标志表达均类似人间充质干细胞(human mesenchymal stem cells,hMSCs)。

hFLSCs作为饲养层细胞可以维持hES细胞的增殖传代达10-15次,hFLSCs饲养层培养的hES细胞经RT-PCR和免疫荧光检测均表达hES细胞特异性的标志,并保持其干性特征。

免疫荧光结果表明hFLSCs和克隆边缘分化hES细胞均表达碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)的受体成纤维细胞生长因子受体1(fibroblast growth factor receptor1,FGFR1),而未分化hES细胞表达胰岛素样生长因子1受体(insulin-like growth factor,IGF1R),提示bFGF通过作用于饲养层细胞和克隆边缘少量分化的细胞来发挥其干性维持的作用。

bFGF是hES细胞体外培养中唯一必需的细胞因子,其在hES细胞的干性维持中发挥着关键的作用。

参考文献

[1]Dynamics of human erythroblast enucleation[J].Miwa Hebiguchi,Makoto Hirokawa,Yong-Mei Guo,Kunie Saito,Hideki Wakui,Atsushi Komatsuda,Naohito Fujishima,Naoto Takahashi,Tsutomu Takahashi,Takehiko Sasaki,Wataru Nunomura,Yuichi Takakuwa,Kenichi Sawada.International Journal of Hematology.2008(5)

[2]Selective mitochondrial autophagy during erythroid maturation[J].Min Chen,Hector Sandoval,Jin Wang.Autophagy.2008(7)

[3]Robust generation of hemangioblastic progenitors from human embryonic stem cells[J].Shi-Jiang Lu,Chenmei Luo,Katherine Holton,Qiang Feng,Yordanka Ivanova,Robert Lanza.Regen.Med..2008(5)

[4]Efficient Hematopoietic Differentiation of Human Embryonic Stem Cells on Stromal Cells Derived from Hematopoietic Niches[J].Cell Stem Cell.2008(1)

[5]习佳飞.人胚胎干细胞诱导分化为成熟红细胞的关键技术研究[D].中国人民解放军军事医学科学院,2009.