0.05%胰酶溶液(含EDTA)的应用

背景^[1-3]

0.05%胰酶溶液(含EDTA)是浓度为0.05%的丝氨酸水解酶溶液，它能把多肽链中赖氨酸和精氨酸残基中的羧基侧切段，水解细胞间的蛋白质，破坏细胞间的连接，从而使组织或贴壁细胞离散成单个细胞。胰酶分散细胞的活性与组织或细胞的特性、胰酶浓度、温度和作用时间有关，在PH 8.0和37℃时，胰酶的作用能力最强，因此使用胰酶时，应把握好浓度、温度和时间，以免消化过度造成细胞损伤。

一般常用胰酶的工作浓度为0.25%，而半贴壁细胞或对胰酶敏感的细胞常采用低浓度（0.05%）的胰酶进行细胞消化。EDTA是化学中一种良好的配合剂，它有六个配位原子，形成的配合物叫做螯合物。EDTA能够螯合Ca2+和Mg2+，从而破坏细胞连接促进细胞的解离，因此在胰酶溶液中常常会加入一定量的EDTA混合使用，以增强解离效果。

注意事项

1、由于不同的组织或者细胞对胰酶的作用反应不一样，因此操作人员应根据实际情况，确定消化时间；消化细胞时间不宜过长，否则会影响细胞贴壁和生长状况；

2、使用本产品时应注意无菌操作，避免污染；

3、不宜长时间放置于室温环境或4℃长期保存；

4、2℃～8℃中解冻，摇匀后使用，切忌反复冻融，用量较少时建议分装冻存。

5、由于D-Hank's平衡盐溶液NaHCO3含量较低（0.35g/L），因此该型胰蛋白酶溶液不能用于5%CO2的环境，若放入CO2培养相，溶液将迅速变酸，使用时应注意；

应用^[4][5]

用于淋巴细胞活化与BMMSCs向脂肪分化的相互影响及可能的临床意义研究

(1) 体外分离、培养、扩增小鼠BMMSCs，并研究其生物学特点。

(2) 培养、扩增再障患者和正常对照BMMSCs，比较两组BMMSCs生物学特性及脂肪分化能力的不同。

(3) 建立免疫相关骨髓衰竭动物模型，观察免疫紊乱条件下模型小鼠骨髓脂肪化程度的改变，并研究该模型BMMSCs的生物学特性。

(4) 研究同基因条件下，活化淋巴细胞对BMMSCs向脂肪分化能力的影响及BMMSCs向脂肪细胞分化后对单个核细胞(MNCs)增殖及活化状态的影响。

方法(1)贴壁筛选法分离纯化BALB／c小鼠BMMSCs，胰酶消化传代，FCM鉴定细胞表型，并在特定诱导剂下诱导向脂肪细胞、成骨细胞及软骨细胞分化。

(2) 体外密度梯度离心法分离培养正常人和再障患者的BMMSCs，观察其形态学的异同，同时用流式细胞仪检测其分子表面抗原以及RT-PCR法检测成脂肪细胞的差异。

(3) C57BL/6小鼠(父本)和BALB／c小鼠(母本)杂交产生CByB6F1小鼠，将F1小鼠γ射线亚致死量照射(4．5Gy)后尾静脉注射母本淋巴细胞，建立免疫相关骨髓衰竭动物模型。记录白细胞，红细胞，血小板及血红蛋白的变化，股骨切片HE染色观察模型小鼠骨髓脂肪化程度，贴壁筛选法分离小鼠BMMSCs，观察其生物学特性的改变。

(4)将Percoll密度梯分离BALB／c小鼠脾脏MNCs，ConA活化后与BALB／c小鼠BMMSCs共培养72小时，Real-time PCR，Western Blot及ELISA检测BMMSCs脂肪分化相关基因和蛋白表达的变化。BMMSCs诱导分化成脂肪细胞，与脾MNCs共培养72小时，CCK-8检测MNCs增殖，流式检测淋巴细胞活化标志的变化。

参考文献

[1]Immunosuppression by mesenchymal stromal cells:From culture to clinic[J].Ben J.Jones,Steven J.McTaggart.Experimental Hematology.2008(6)

[2]The emerging role of adipokines as mediators of inflammation and immune responses[J].Francisca Lago,Carlos Dieguez,Juan Gómez-Reino,Oreste Gualillo.Cytokine and Growth Factor Reviews.2007(3)

[3]Mesenchymal Stromal Cells[J].Edwin M.Horwitz,Michael Andreef,Francesco Frassoni.Biology of Blood and Marrow Transplantation.2007

[4]Mesenchymal stem cell tissue engineering:Techniques for isolation,expansion and application[J].Ippokratis Pountos,Diane Corscadden,Paul Emery,Peter V.Giannoudis.Injury.2007

[5]王海燕.淋巴细胞活化与BMMSCs向脂肪分化的相互影响及可能的临床意义[D].复旦大学,2009.