恒河猴骨髓间充质干细胞完全培养基的应用

背景^[1-3]

恒河猴骨髓间充质干细胞完全培养基是恒河猴骨髓间充质干细胞体外培养的含血清培养基，可以在恒河猴骨髓间充质干细胞体外传代和分化培养。

恒河猴（Macaca mulatta）被广泛应用于生命科学研究领域,是被研究得最清楚的旧世界猴（旧世界猴与新世界猴的主要差别在于鼻部，新世界猴的鼻部软骨间隔很宽，鼻孔开向侧方，鼻孔间距较宽，旧世界猴的鼻间距则很窄，恒河猴组织结构、生理功能与人相似，被广泛应用于生命科学研究领域。

骨髓原始间充质干细胞是骨髓基质干细胞，是人们在哺乳动物的骨髓基质中发现的一种具有分化形成骨、软骨、脂肪、神经及成肌细胞的多种分化潜能的细胞亚群。它们对骨髓中的造血干细胞（HSC）不仅有机械支持作用，还能分泌多种生长因子（如IL-6，IL-11，LIF，M-CSF及SCF等）来支持造血。

基础培养基添加血清、抗生素等物质后，叫完全培养基，也叫（血清）细胞培养基。基础培养基只能维持细胞生存，要想使细胞生长和繁殖，还需添加天然培养基，常用的是牛血清，因为牛血清中含有促细胞增殖的各种生长因子和其他多种有利于细胞生存的物质。此外为防止污染，培养液中尚需加一定量的抗生素。完全培养基根据添加血清量的多少，可分为细胞生长培养基和细胞维持培养基，用于不同细胞和不同研究。

应用^[4][5]

用于骨髓间充质干细胞体外诱导为角膜内皮样细胞的实验研究

利用骨髓间充质干细胞多向分化潜能,将骨髓间充质干细胞诱导分化为角膜内皮样细胞;探讨体外分离提纯和培养树鼩及恒河猴骨髓间充质干细胞(BMSCs)的生物学特性:形态、生长曲线、活性,对其多向分化潜能和表型进行初步鉴定,并将树鼩及恒河猴各结果对比。将树鼩BMSCs与晶体、虹膜、角膜内皮细胞非接触性共培养,分析体外诱导成为角膜内皮样细胞的可行性,并进一步探讨恒河猴骨髓间充质干细胞诱导分化为角膜内皮样细胞的可能性及实验方案。

方法：取树鼩及恒河猴胫骨及股骨,去除骨骺端将骨髓冲出收集,采用密度梯度离心法和全骨髓贴壁培养法提取培养BMSCs,利用MTS检测细胞活性的方法绘制二代及七代细胞生长曲线,使用FITC Annexin V-PI细胞凋亡试剂盒双染法检测细胞凋亡情况,利用流式细胞仪分析法检测细胞表面标志物CD29、CD34、CD45、CD90、CD147的表达。

结果：树鼩及恒河猴提取细胞多为长梭形,形态大小均一,少量细胞有大小数量不等的触角,或呈星形;第2代和第7代的细胞生长曲线呈S形,P7代细胞增殖能力弱于P2代;树鼩细胞凋亡检测可估算出活细胞的比例为90.120%,死亡细胞为8.77%,凋亡细胞为0.540%;成功培养出树鼩BMSCs第3代,流式细胞仪检测CD34、CD45阴性表达分别为0.00%、0.00%,CD90、CD29、CD147阳性表达分别为96.4%,95.8%,91.3%。

角膜内皮细胞诱导培养基诱导骨髓间充质干细胞两周后,细胞NSE染色阴性,油红0染色出现大量红色脂滴,证实为脂肪细胞。晶体匀浆共培养BMSCsNSE染色阳性,虹膜和角膜内皮细胞共培养BMSCs NSE染色阴性。

恒河猴BMSCs细胞凋亡检测可估算出活细胞的比例为73.83%,死亡细胞为21.76%,凋亡细胞为4.27%;成功培养出恒河猴BMSCs第3代,恒河猴BMSCs流式细胞仪检测CD34、CD45阴性表达分别为0.00%、0.00%,CD90、CD29、CD147阳性表达分别为98.8%,96.4%,89.7%。

参考文献

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[2]A 3D culture system enhances the ability of human bone marrow stromal cells to support the growth of limbal stem/progenitor cells[J].Sheyla González,Hua Mei,Martin N.Nakatsu,Elfren R.Baclagon,Sophie X.Deng.Stem Cell Research.2016

[3]The Morphofunctional Effect of the Transplantation of Bone Marrow Stromal Cells and Predegenerated Peripheral Nerve in Chronic Paraplegic Rat Model via Spinal Cord Transection[J].Vinnitsa Buzoianu-Anguiano,Sandra Orozco-Suárez,Elisa García-Vences,Sara Caballero-Chacón,Gabriel Guizar-Sahagún,Luis Chavez-Sanchez,Israel Grijalva,John Gensel.Neural Plasticity.2015

[4]Culture medium from TNF-α–stimulated mesenchymal stem cells attenuates allergic conjunctivitis through multiple antiallergic mechanisms[J].Wenru Su,Qian Wan,Jingwen Huang,Longhui Han,Xiaoqing Chen,Guihua Chen,Nancy Olsen,Song Guo Zheng,Dan Liang.The Journal of Allergy and Clinical Immunology.2015(2)

[5]董婧婧.骨髓间充质干细胞体外诱导为角膜内皮样细胞的实验研究[D].昆明医科大学,2017.