大鼠小梁网细胞的应用

背景^[1-3]

大鼠小梁网细胞分离自眼球组织采用组织贴块法制备而来，细胞纯度可达85%以上，且不含有HIV-1、HBV、HCV、支原体、细菌、酵母和真菌等。小梁网由角膜基质纤维、后界膜和角膜内皮向后扩展而成，覆盖在巩膜静脉窦的内侧。小梁网细胞在眼内压调节中起着关键作用；小梁网细胞内有特定的神经递质和神经肽受体，其中包括肾上腺素、乙酰胆碱和神经肽Y。

青光眼是由于眼内压力升高而造成的一种不可逆致盲眼病，小梁网细胞的体外培养是青光眼病因学研究的重要手段之一。在小梁网细胞中，一长串的血管活性多肽和生长因子能够触发细胞内信号传导机制，小梁网细胞可合成不同类型的细胞外基质蛋白以及金属蛋白酶。

形态学观察可见，刚从组织块长出的原代细胞，形态各异，多数呈星状或不规则形。细胞有胞突，核椭圆形，胞体肥大，胞浆丰富，且可见吞噬颗粒。随着细胞的增生及相互融合为单层，细胞的形态趋于一致。胞浆的色素颗粒及胞突消失，排列紧密呈类似上皮细胞的扁椭圆形或不规则形。胞体透亮，包膜清晰。

应用^[4][5]

用于MYOC基因在原发性开角型青光眼发病过程中的作用研究

采用地塞米松处理体外培养的小梁网细胞,以便制作出近似POAG发病的病理生理改变,并运用siRNA干扰技术探讨MYOC基因在POAG发病过程中的作用。

方法1、大鼠小梁网细胞的培养及鉴定:将体外培养的3代小梁网细胞用于细胞鉴定及实验。细胞免疫组织化学鉴定:3代细胞达到融合以后,进行抗兔的纤维粘连蛋白（fibronectin,FN）、层粘连蛋白（laminin,LN）和神经元特异性烯醇化酶（neuron-specific enolase,NSE）的免疫细胞化学染色鉴定。

2、地塞米松培养大鼠小梁网细胞、培养后MYOC基因表达量的改变及细胞凋亡率检测:3代的大鼠小梁网细胞,用终浓度为10-7M地塞米松的15%FBS培养基培养7天,观察地塞米松处理后的细胞数目、形态、凋亡率的变化情况,并运用Real-timePCR方法检测MYOC基因表达量的改变。

3、检测MYOC基因作用:（1）MYOC突变分析:运用RT-PCR方法扩增MYOC基因的cDNA,测序,并进行突变分析。（2）siRNA干扰技术:设立三个组别,分别为空白组,空质粒干扰组及地塞米松处理组,运用siRNA干扰各个实验组的大鼠小梁网细胞,观察siRNA干扰后地塞米松处理组与正常细胞组比较后的细胞数目、形态、凋亡率的变化情况。

结果：大鼠原代小梁网细胞倒置显微镜观察结果组织块接种后5～10天,开始有细胞从组织块边缘向外生长或者在组织块周围见数个游离的细胞群落。显微镜下细胞形态多样:梭形,椭圆形,不规则形等,细胞体积较大。细胞形态介于上皮细胞和成纤维细胞之间。原代细胞生长缓慢,一般需要10～15天才能达到融合,形成单层贴壁细胞,融合以后细胞形态逐渐接近。

参考文献

[1]Elevated amounts of myocilin in the aqueous humor of transgenic mice cause significant changes in ocular gene expression[J].Walter Paper,Markus Kroeber,Sebastian Heersink,Dietrich A.Stephan,Rudolf Fuchshofer,Paul Russell,Ernst R.Tamm.Experimental Eye Research.2008(3)

[2]Aqueous humor myocilin protein levels in normal,genetic carriers,and glaucoma Beagles[J].Veterinary Ophthalmology.2008(3)

[3]Extracellular myocilin affects activity of human trabecular meshwork cells[J].KellyWentz‐Hunter,RyoKubota,XiangShen,Beatrice Y.J.T.Yue.J.Cell.Physiol..2004(1)

[4]Accumulation of mutant myocilins in ER leads to ER stress and potential cytotoxicity in human trabecular meshwork cells[J].Myung Kuk Joe,Seongsoo Sohn,Wonhee Hur,Younkyong Moon,Young Ran Choi,Changwon Kee.Biochemical and Biophysical Research Communications.2003(3)

[5]宁波.MYOC基因在原发性开角型青光眼发病过程中的作用研究[D].中国医科大学,2009.