盐检定培养基Ⅲ的应用

背景^[1-3]

盐检定培养基Ⅲ用于用于布氏菌疫苗生产。性状:有各种不同的配方，如牛肉膏粉90g、蛋白胨270g、食盐136g、琼脂粉520g、无水碳酸钠9g。易潮解。加水煮沸溶化后呈浅黄色半透明液体，pH7.4（±0.2），冷至45℃开始凝固。

使用方法：称取本品33g，加入蒸馏水或去离子水1 L，搅拌加热煮沸至完全溶解,分装试管或三角瓶，121℃高压灭菌15min备用。

布鲁氏杆菌（Brucella）是一种革兰氏阴性的不运动细菌，无荚膜（光滑型有微荚膜），触酶、氧化酶阳性，绝对嗜氧菌，可还原硝酸盐，细胞内寄生，可以在很多种家畜体内存活。

布鲁氏杆菌会引起布鲁氏杆菌病，简称布病，它是一种人畜共患的慢性传染性疾病，危害较大。在我国该疾病的主要传染源为牛、羊、猪3种牲畜，其中以羊型布鲁氏杆菌对人体的传播性最强，致病率最高，危害最为严重。

布鲁氏杆菌各个种的形态几乎一样，染色后在普通光学显微镜下呈微小的球状、球杆状和卵圆形。羊布鲁氏杆菌以球形和卵圆形多见，大小约0.3~0.6um。其他种布鲁氏杆菌多呈球杆状或短杆状，比羊布鲁氏杆菌也大些，约在0.6~2.5μm之间。涂片标本上无特殊排列，常单个存在，极少见到呈两个相连或短链排列。无鞭毛不运动，无菌毛，不形成芽胞，毒力菌株有菲薄的微荚膜，多数人认为该菌也无荚膜。

应用^[4][5]

用于布氏杆菌菌壳的制备及其特性研究

菌壳(Bacterial ghosts)作为一种新型灭活疫苗,由导入到细菌细胞内的噬菌体PhiX174裂解蛋白E表达后,在细菌表面形成跨膜孔洞,通过跨膜孔道,细菌内容物即可流出细胞,从而使细菌的核酸、核糖体等内含物缺失,形成细菌空壳。这种方法是以非变性方法来灭活细菌,使菌体保持了原始的细胞表面抗原结构。此外,细菌外膜的一些天然结构(如脂多糖、肽聚糖等)使菌壳自身具有内在的佐剂活性。菌壳的制备过程保证了布氏杆菌具有原始的细胞形态和天然表面抗原,能为机体提供良好的免疫原性。并且由于细胞内容物的流失确保了菌壳的安全性。

研究首先将温控调节系统λpL/pR-cI857和噬菌体裂解基因E克隆到穿梭质粒pBBR1MCS-2中,构建出重组温控裂解质粒pBBR1MCS-E;然后将该重组质粒电转化入布氏杆菌S2疫苗株,通过温度变化诱导E基因的表达而制备布氏杆菌菌壳;再对布氏杆菌菌壳的形态、裂解率、安全性和免疫学特性进行了研究。

结果表明,裂解质粒对布氏杆菌裂解率可达99.99%,通过高渗溶液冻融后可完全消除其中残存的活菌。菌壳保持细胞的表面抗原结构,但由于细胞内容物外流而使细胞形态发生明显皱缩。

小鼠接种布氏杆菌菌壳(BSG)、布氏杆菌甲醛灭活菌(FKB)和布氏杆菌活疫苗(S2)后,S2组小鼠体重大幅下降、精神萎靡、严重耸毛,部分小鼠死亡(5/10),解剖后S2组小鼠脾脏极度肿大,平均脾重为0.406g/只小鼠,与对照组差异显著,而BSG组和FKB组生长正常,脾重正常,与对照组无显著差异,表明布氏杆菌菌壳具有良好的安全性。

血清抗体检测结果显示,BSG组和S2组小鼠均可产生较高血清抗体效价,BSG组效价略高于S2组,免疫后6-7周抗体滴度达到最高(约6400),免疫8周后仍可检测到高滴度的抗体。

参考文献

[1]Towards a Brucella vaccine for humans[J].Stuart D.Perkins,Sophie J.Smither,Helen S.Atkins.FEMS Microbiology Reviews.2010(3)

[2]Mice orally vaccinated with Edwardsiella tarda ghosts are significantly protected against infection[J].Xuepeng Wang,Chengping Lu.Vaccine.2009(10)

[3]Generation of Vibrio anguillarum Ghost by Coexpression of PhiX 174 Lysis E gene and Staphylococcal Nuclease A Gene[J].Se Ryun Kwon,Yue Jai Kang,Dong Jin Lee,Eun Hye Lee,Yoon Kwon Nam,Sung Koo Kim,Ki Hong Kim.Molecular Biotechnology.2009(2)

[4]The new global map of human brucellosis[J].Georgios Pappas,Photini Papadimitriou,Nikolaos Akritidis,Leonidas Christou,Epameinondas V Tsianos.The Lancet Infectious Diseases.2006(2)

[5]刘爽.布氏杆菌菌壳的制备及其特性研究[D].吉林大学,2011.