人角化细胞生长因子(KGF)ELISA KIT的应用

背景^[1-3]

人角化细胞生长因子(KGF)ELISA KIT用于体外定量检测血清、血浆、组织、细胞上清及相关液体样本中人角化细胞生长因子（KGF）的含量。试剂盒采用双抗体一步夹心法酶联免疫吸附试验（ELISA）。往预先包被人角化细胞生长因子（KGF）捕获抗体的包被微孔中，依次加入标本、标准品、HRP标记的检测抗体，经过温育并彻底洗涤。用底物TMB显色，TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的人角化细胞生长因子（KGF）呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），计算样品浓度。

样本处理及要求

1.血清：全血标本请于室温放置2小时或4℃过夜后于1000g离心20分钟，取上清即可检测，或将标本放于-20℃或-80℃保存，但应避免反复冻融。

2.血浆：可用EDTA或肝素作为抗凝剂，标本采集后30分钟内于2-8°C 1000g离心20分钟，或将标本放于-20℃或-80℃保存，但应避免反复冻融。

3.细胞培养物上清或其它生物标本：1000g离心20分钟，取上清即可检测，或将标本放于-20℃或-80℃保存，但应避免反复冻融。

注：标本溶血会影响最后检测结果，因此溶血标本不宜进行此项检测。

操作步骤

1.从室温平衡20min后的铝箔袋中取出所需板条，剩余板条用自封袋密封放回4℃。

2.设置标准品孔和样本孔，标准品孔各加不同浓度的标准品50μL；

3.样本孔中加入待测样本50μL；空白孔不加。

4.除空白孔外，标准品孔和样本孔中每孔加入辣根过氧化物酶（HRP）标记的检测抗体100μL，用封板膜封住反应孔，37℃水浴锅或恒温箱温育60min。

5.弃去液体，吸水纸上拍干，每孔加满洗涤液（350μL），静置1min，甩去洗涤液，吸水纸上拍干，如此重复洗板5次（也可用洗板机洗板）。

6.每孔加入底物A、B各50μL，37℃避光孵育15min。

7.每孔加入终止液50μL，15min内，在450nm波长处测定各孔的OD值。

应用^[4][5]

用于人角化细胞生长因子-1的克隆及其在骨髓基质细胞中的表达

从人胚肺成纤维细胞中克隆人角化细胞生长因子-1(KGF-1)编码区序列,构建真核荧光表达载体。方法从人胚肺成纤维细胞中提取总RNA,通过反转录PCR获取KGF-1cDNA编码区序列,将其与pIRES2-EGFP质粒载体连接,构建重组表达载体pIRES2-EGFP/KGF-1,测序鉴定。将pIRES2-EGFP/KGF-1瞬时转染骨髓基质细胞(marrow stroma cells,MSCs)48h后,免疫荧光法检测骨髓基质细胞是否存在KGF-1蛋白的表达。结果构建的重组质粒pIRES2-EGFP/KGF-1经序列分析示与国外文献报道一致。

KGF-1免疫荧光法激光共聚焦检测结果证实,pIRES2-EGFP/KGF-1转染骨髓基质细胞后,存在KGF-1蛋白的表达,定位于细胞浆内。结论成功构建重组真核荧光表达载体pIRES2-EGFP/KGF-1,初步探讨了该基因在骨髓基质细胞中的表达,为其在皮肤组织工程的运用奠定了基础。

参考文献

[1]Efficacy of growth factors in the accelerated closure of interstices in explanted meshed human skin grafts.Smith P D,Polo M,Soler P M,et al.Journal of Burn Care and Rehabilitation.2000

[2]Purification and characterization of a newly identified growth factor specific for epithelial cells.Rubin J S,Osada H,Finch P W,et al.Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America.1989

[3]Transfection with keratinocyte growth factor 1 cDNA with electroporation improves wound healing in an aged mouse model.G.P.Marti MD M.A.Makary M MPH M.Ferguson PhD J.Wang BS R.Dieb MD A.M.Marti M.P.Lin,JHUSOMIII P.Bonde M FRCS M.Duncan M FACSa and J.W.Harmon M FACSa.Journal of Surgical Research.2004

[4]Interpenetrating polymer networks containing gelatin modified with PEGylated RGD and soluble KGF:Synthesis,characterization,and application in in vivo critical dermal wound.Waldeck H,Chung AS,Kao WJ.Journal of Biomedical Materials Research.2007

[5]朱国强,李袁飞,冯晋斌,胡德华.人角化细胞生长因子-1的克隆及其在骨髓基质细胞中的表达[J].西南国防医药,2010,20(11):1169-1172.