小鼠肺上皮细胞的应用

背景^[1-3]

小鼠肺上皮细胞分离自小鼠肺组织，肺泡上皮细胞(AECs)是肺细胞的主要类型之一，可用于分析肺上皮细胞对外界因素的反应。因此，小鼠肺部的AECs可以作为疾病的体外模型。AECs对于研究肺的发育、损伤和修复是必不可少的。从事呼吸系统疾病如急性呼吸窘迫综合征(ARDS)、囊性纤维化、肺气肿和肺炎研究的人员通常依赖AECs进行研究。

肺泡上皮细胞有两种类型：I型肺泡上皮细胞(AECI)和II型肺泡上皮细胞(AECII)。

AECI很薄，是一种细长的鳞状细胞，主要帮助肺泡和血液之间的气体交换。AECII是一种小立方形的细胞，分泌肺表面活性物质以降低肺泡表面张力。由于AECII更丰富(大约占ACEs的60%)，它们比AECI更容易分离。因此，大多数人从肺中分离出初生AECII细胞，然后对它们进行分化，以获得AECI样表型。

体外原代培养的AECⅡ约18h已经贴壁生长。将细胞悬液接种入培养瓶中，置37℃，5%CO2培养箱内孵育45min，此时贴壁的细胞多为成纤维细胞，悬在培养液中的细胞多数为AECⅡ、部分成纤维细胞及其他杂细胞。

将培养液吸出接种于另一培养瓶中，同样继续37℃孵育40min，连续2~3次，最后吸出培养液，800r/min离心5min，去上清，用含10%胎牛血清的DMEM/F12重悬细胞沉淀，按密度为4x105个细胞／cm2接种于培养瓶中，37℃，5%CO2条件下培养24h后换液，去除未贴壁细胞继续培养3~6d，倒置显微镜观察细胞生长状态和形态特征。

培养48h细胞状态良好，可进行进一步的后续实验。培养36~48h，细胞平展呈多边形，逐渐融合，相互连接成细胞单层。培养大约72h后，细胞逐渐变得扁平，细胞内颗粒较前减少，有排空现象，胞质颜色变淡。

培养5~6d后，细胞内充满空泡，无法辨认Ⅱ型细胞形态。

应用^[4][5]

用于乙酰化修饰JAK2/STAT3对AngⅡ诱导小鼠肺泡上皮细胞间质转分化影响的机制研究

研究JAK2/STAT3信号通路对AngⅡ诱导小鼠肺泡上皮细胞间质转分化的影响。

方法：(1)复制小鼠肺泡上皮细胞间质转分化模型,依次用浓度为0.1umol/l、lumol/l、10umol/l的AngⅡ干预贴壁生长的MLE-12细胞,48h后收集蛋白,Western blot检测α-SMA表达,明确AngⅡ的干预浓度。

(2) 将体外培养MLE-12细胞分为正常对照组、DMSO对照组、AngⅡ刺激组、AngⅡ+AG490组,正常对照组给予10ul PBS,DMSO对照组给予10umol/LDMSO+lumol/LAngⅡ,AngⅡ刺激组给予1 umol/L AngⅡ,AngⅡ+AG490组给予1 Oumol/L AG490+1umol/L AngⅡ,干预30min后收集蛋白,采用Western blot检测信号通路蛋白：JAK2、磷酸化JAK2(p-JAK2)、STAT3、磷酸化STAT3(p-STAT3)的表达水平。

(3) 分组干预48h后收集蛋白,检测上皮细胞的标记物E-钙黏素(E-cadherin),间质细胞的标记物平滑肌肌动蛋白(α-SMA)及促纤维化因子TGF-β的表达,通过上皮向间质转分化的标记物,评估JAK2/STAT3信号通路在参与AngⅡ诱导小鼠肺泡上皮细胞向成纤维细胞转分化过程中的作用。

(4)分组干预48h后,用CCK8法检测不同干预药物对MLE-12细胞活性的影响。结果：(1)不同浓度AngⅡ对MLE-12细胞表达α-SMA的影响。与空白对照组相比,lumol/1 AngⅡ干预48h后MLE-12细胞表达的α-SMA显著增加(P<0.05)。

参考文献

[1]JAK/STAT3 signaling is required for TGF-β-induced epithelial-mesenchymaltransition in lung cancer cells[J].Reng-Yun Liu,Yuanyuan Zeng,Zhe Lei,Longqiang Wang,Haiping Yang,Zeyi Liu,Jun Zhao,Hong-Tao Zhang.International Journal of Oncology.2014(5)

[2]American ginseng inhibits vascular smooth muscle cell proliferation via suppressing Jak/Stat pathway[J].Qi Wu,Wenjuan Wang,Siying Li,Prakash Nagarkatti,Mitzi Nagarkatti,Anthony Windust,Xing Li Wang,Dongqi Tang,Taixing Cui.Journal of Ethnopharmacology.2012(3)

[3]Angiotensin converting enzyme 2 abrogates bleomycin-induced lung injury[J].G.Rey-Parra,A.Vadivel,L.Coltan,A.Hall,F.Eaton,M.Schuster,H.Loibner,J.Penninger,Z.Kassiri,G.Oudit,B.Thébaud.Journal of Molecular Medicine.2012(6)

[4]Angiotensin signalling in pulmonary fibrosis[J].Bruce D.Uhal,Xiaopeng Li,Christopher C.Piasecki,Maria Molina-Molina.International Journal of Biochemistry and Cell Biology.2011(3)

[5]卢森.乙酰化修饰JAK2/STAT3对AngⅡ诱导小鼠肺泡上皮细胞间质转分化影响的机制研究[D].东南大学,2015.