Biotin anti-mouse CD28 Biotin的应用

背景^[1-3]

Biotin anti-mouse CD28 Biotin是以anti-mouse CD28为制得的anti-mouse CD28 Biotin抗体，可以特异性结合mouse CD28。CD28是T淋巴细胞表面表达的共刺激分子，对T细胞的活化起到重要作用。它与APC（抗原递呈细胞）上的B7分子结合，介导T细胞的共刺激并促进其存活、增殖以及产生细胞因子。

对于Tc和Th细胞来说，CD28信号传导降低了T细胞活化的阈值，促进了T细胞的增殖和分化。在没有CD28共刺激存在时，初始T细胞不会被活化，反而变成不应答。通过CD28的共刺激有多方面重要的分子效应：1.T细胞表面IL-2R（白介素-2受体）被诱导表达，从而允许细胞接收第三信号；2.Th细胞开始分泌大量的细胞因子和趋化因子；3.在Th和Tc细胞内其他共刺激和调节分子被诱导表达和上调表达。

生物素（Biotin）为B族维生素之一，又称维生素H、维生素B7、辅酶R（Coenzyme R）等。是20世纪30年代在研究酵母生长因子和根瘤菌的生长与呼吸促进因子时，从肝中发现的一种可以防治由于喂食生鸡蛋蛋白诱导的大鼠脱毛和皮肤损伤的因子。

生物素可以用作核酸探针的标记物，它能与核酸分子的UTP或dUTP 5‘位上的C相结合，并可与亲和素结合而被检测。在检测的过程中，生物素只用作固定连接，而不用作信号检测。

应用^[4][5]

用于补肾解毒通络方对急性期EAE大鼠的作用及外周血CD28、CTLA-4的影响研究

通过观察补肾解毒通络方干预实验性脑脊髓炎(Experimental autoimmune encephalomyelitis,EAE)大鼠体重、神经功能评分的改变,HE染色研究EAE大鼠的大脑、脊髓多个层面的病理变化,测定不同组别大鼠干预后血清中CD4~+T细胞表面CD28、CTLA-4的表达量。探寻补肾解毒通络方在干预急性期多发性硬化可能的作用机理,为中西医结合治疗多发性硬化较单纯西药或中药治疗更有优势提供一定的依据。

方法1.动物分组:将80只雌性SD大鼠运用SPSS22.0随机区组法分为空白组、模型组、中药组、西药组、中西药组,各组16只。

2. 建立EAE大鼠模型:制备抗原:在无菌条件下取豚鼠全脊髓,精确称取重量,将等体积的冰生理盐水与之混合,盛在玻璃匀浆器中反复冰冻(因豚鼠脊髓中富含的有效成分MBP在高温下易失活)、研磨,期间过程不得少于30min,直至将豚鼠全脊髓匀浆(guinea pig spinal cord homogenate,GPSCH)研磨为外观乳白色液体。最后与等体积的完全弗氏佐剂在低温状态下(其中含卡介苗8mg/ml)充分混合,制备稳定油包水型抗原乳剂。采用多部位注射法诱导雌性SD大鼠制作EAE模型。空白组给予大鼠脚垫皮内及背部皮下分别注射0.4ml和0.1ml的生理盐水。自造模当日起,每日详细记录大鼠精神状态、饮食情况、体重变化及神经功能评分。

3. 给药方法:自免疫第2日起,空白组、模型组每天给予生理盐水1ml灌胃;中药组每天给予补肾解毒通络方药液,按30g/kg药量给予中药灌胃;激素组每天按6.17mg/kg药量给予醋酸泼尼松龙灌胃;中药加激素组每天按30g/kg中药剂量和6.17mg/kg醋酸泼尼松龙灌胃,连续灌胃17天。

4.取材、观察病理及测定指标:于免疫第18天,采用腹主动脉取血法收集大鼠周围血3ml,将带有不同荧光染色剂的CD4~+T细胞单克隆抗体、CD28单克隆抗体、CTLA-4单克隆抗体与血液充分混合,清除血液中红细胞,采用全血直标法上流式细胞机测外周血中CD4~+T细胞表面CD28、CTLA-4的表达量;并用冰生理盐水灌注心脏,取大鼠脑组织及腰膨大部位,将40%的甲醛加入适量的蒸馏水,配为4%甲醛溶液,将组织置于其中浸泡固定。切片石蜡包埋组织,切片,HE法染色观察病理改变。

参考文献

[1]Tissue Transglutaminase contributes to experimental multiple sclerosis pathogenesis and clinical outcome by promoting macrophage migration[J].Miriam E.van Strien,Helga E.de Vries,Navina L.Chrobok,John G.J.M.Bol,John J.P.Breve,Susanne M.P.van der Pol,Gijs Kooij,Jaap D.van Buul,Marcela Karpuj,Lawrence Steinman,Micha M.Wilhelmus,Claudia Sestito,Benjamin Drukarch,Anne-Marie Van Dam.Brain Behavior and Immunity.2015

[2]Focal transient CNS vessel leak provides a tissue niche for sequential immune cell accumulation during the asymptomatic phase of EAE induction[J].Deborah S.Barkauskas,R.Dixon Dorand,Jay T.Myers,Teresa A.Evans,Kestutis J.Barkauskas,David Askew,Robert Purgert,Alex Y.Huang.Experimental Neurology.2015

[3]Cell surface levels of endothelial ICAM‐1 influence the transcellular or paracellular T‐cell diapedesis across the blood–brain barrier[J].Michael Abadier,Neda Haghayegh Jahromi,Ludmila Cardoso Alves,Rémy Boscacci,Dietmar Vestweber,Scott Barnum,Urban Deutsch,Britta Engelhardt,Ruth Lyck.Eur.J.Immunol..2015(4)

[4]Matrine suppresses expression of adhesion molecules and chemokines as a mechanism underlying its therapeutic effect in CNS autoimmunity[J].Quan-Cheng Kan,Lin Zhu,Nan Liu,Guang-Xian Zhang.Immunologic Research.2013(1)

[5]鲁晓昊.补肾解毒通络方对急性期EAE大鼠的作用及外周血CD28、CTLA-4的影响[D].河南中医药大学,2017.